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1、发酵液中还原糖含量测定（3,5-二硝基水杨酸比色法）实验目的1、掌握还原糖测定的基本原理2、学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类。单糖都是还原糖，双糖和多糖不一 定是还原糖，例如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用各种糖 的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来。对非还原性 的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成还原性单糖进行测定，再分别求出样品 中还原糖和总糖的含量（常以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热可被氧化成糖酸及其它产物，而氧化剂3,5-二硝基 水杨酸则被还原
2、为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量 与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在540nm波长下测定光 密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖 水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以系数0.9。三、实验材料和试剂1、实验材料发酵液2、实验试剂1mg/ml葡萄糖标准液准确称取80C烘至恒重的分析纯葡萄糖lOOmg,置于小烧杯中，加少量 蒸馏水溶解后，转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml,混匀，4C 冰箱中保存备用。3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂将 6.3g DNS 和 262ml
3、2M NaOH 溶液，加到 500ml 含有 185g 酒石酸 钾钠的热水溶液中，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加 蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。四、实验器材具塞璃玻刻度试管：20mlx8移液管：2mlx2； 10mlx1微量移液器：1000 口 Lxl容量瓶： 100ml恒温水浴锅沸水浴可见光分光光度计五、操作步骤 1、制作葡萄糖标准曲线取 7 支具塞刻度试管编号，按表 1 分别加入浓度为 1mg/ml 的葡萄糖标准液、 蒸馏水和 DNS 试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。表 1 葡萄糖标准曲线制作碍口 1mg/ml葡萄糖蒸馏水 (ml)DNS (ml)
4、葡萄糖含量(mg)光密度值 (OD-540nm)标准液(ml)0021.5010.21.81.50.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.851.01.01.51.061.20.81.51.2将各管摇匀，在沸水浴中准确加热 5min 取出，流水冷却至室温，用蒸馏水 补足至10ml，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0 号管调零点，分别测出 16 号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量 (mg)为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。2、发酵液中还原糖的测定取 2 支具塞刻度试管，编号，按表 2 所示分别加入待测液和显色剂，空
5、白调零可使用制作标准曲线的 0 号管。加热、定容和比色等其余操作与制作 标准曲线相同。表 2 样品还原糖测定管号发酵液待 测液(mL)总糖待测 液( mL)蒸馏水 ( mL)DNS( mL )光密度值( OD-540nm)査曲线葡萄糖量(mg)70.51.51.5五、结果与计算计算出 7 号管光密度值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下 式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。查曲线所得葡萄糖毫克数X提取液总体积/测定时取用体积还原糖() =X100样品毫克数六、注意1. 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点比色2. 若比色液颜色过深，其吸光度可能超出标准曲线浓度范围，可将样液适当稀释后再显色测定
