《流式表面染色步骤》由会员分享，可在线阅读，更多相关《流式表面染色步骤（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、淋巴组织细胞或培养细胞表面抗原流式检测步骤（一）细胞样品准备 收集组织或细胞1. 取出目的组织（如:脾脏、淋巴结、胸腺、骨髓等），迅速浸泡在 Cell Staining Buffer （BioLegend Cat. #420201） 中，并应用研磨及过滤等方法制备成单细胞悬液；如果为体外培养细胞，直接用 Cell Staining Buffer 重悬细 胞后进行下一步操作。2. 添加Cell Staining Buffer至约15mL，离心（350 x g） 5分钟后弃去上清液。 裂解红细胞（脾脏组织等）3. 如样品为脾脏组织细胞，需要裂解红细胞。把10X红细胞裂解液（RBC Lysis Bu
2、ffer ） （BioLegend Cat. #420301）用去离子水稀释成1X工作液。然后用3 ml红细胞裂解工作液重悬细胞后，在冰上孵育5分钟。4. 加入10 ml Cell Staining Buffer到管中；离心（350 x g）5分钟后弃去上清液。5. 重复洗涤细胞一次（步骤 2）。6. 用Cell Staining Buffer重悬细胞后计数，稀释细胞为5-10 x 106细胞/ml，然后每支流式检测管中加入 100uL细胞悬液（5-10 x 105细胞/管）。Fc 受体封闭（可选）7. Fc受体的封闭过程是为了减少抗体的非特异性结合造成的影响；对于小鼠细胞的检测，BioLeg
3、end公司 的纯化抗小鼠CD16/CD32抗体特异识别并结合Fcy R III/II （Cat. #101302, clone 93），适用于封闭抗体非特 异染色；实验操作为用5-10 gg/ml纯化CD16/32抗体与细胞冰上孵育10分钟。而对于市面上没有可用的人 或大鼠封闭抗体，可以采用加入无关纯化免疫球蛋白（如与所用荧光标记抗体相同种属和抗体亚型）到细 胞样品中进行封闭。（二）细胞表面荧光染色步骤8. 在每个流式检测管中加入适量的预稀释好的一抗（荧光标记抗体、生物标记抗体或纯化抗体）；在空白 管/孔或同型对照管/孔中加入与抗体相同量的对照试剂。然后各管避光冰浴或在4C冰箱中孵育15-20
4、分钟。（注：有些抗体可能需要更长的孵育时间，建议实验者进行预试验摸索）9. 加入至少2mL Cell Staining Buffer，然后350g离心5分钟后弃去上清液；重复洗涤过程两次。10. （间接标记）若使用的一抗是纯化或生物素标记抗体，则每管/孔加入适量稀释好的荧光标记二抗或荧光 标记亲和素（SAv-PE, BioLegend Cat. # 405204）后于冰浴或在4C冰箱中避光孵育15-20分钟。11. 重复洗涤细胞一次（按步骤 9）。12. 用0.5 ml Cell Staining Buffer重悬细胞；如有必要，加入10uL（0.25 gg）/million细胞的核染料 7-
5、AAD（BioLegend Cat. #420401）以区分活、死细胞，冰上孵育3-5分钟。（注：我们不建议7-AAD与PE-Cy5 或 PE-Cy7 等荧光标记抗体联用） 13.上机检测并分析结果。B.全血细胞表面抗原的流式检测步骤1. 往含有 100uL 抗凝全血的流式检测管中加入适量的预稀释好的一抗（荧光标记抗体、生物标记抗体或纯 化抗体）。2. 室温避光孵育 15-20分钟。（注：有些结合能力较低的抗体可能需要更长的孵育时间，建议实验者进行 预试验摸索）3. 把10X红细胞裂解液（RBC Lysis Buffer ） （BioLegend Cat. #420301）用去离子水稀释成1X
6、工作液，用之前 恢复至室温。加入2 ml 红细胞裂解工作液到含全血/一抗的检测管中，室温孵育 10分钟。4.350g 离心 5 分钟后弃去上清液。5. 加入至少2mL Cell Staining Buffer，然后350g离心5分钟后弃去上清液。6. （间接标记）若使用的一抗是纯化或生物素标记抗体，则每管/孔加入适量稀释好的荧光标记二抗或荧光 标记亲和素（SAv-PE, BioLegend Cat. # 405204）后室温避光孵育15-20分钟。7. 重复洗涤细胞一次（按步骤 5）。8.用 500ul Staining Buffer 或 500ul 2%的多聚甲醛固定液重悬细胞。9. 上机检测并分析结果。
