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1、抗生素发酵生产工艺1. 青霉素发酵工艺的建立对抗生素工业有何意义？青霉素是发现最早，最卓越的一种B-内酰胺类抗生素，它是抗生素工业的首要产品，青霉素是各种半合成抗生素的原料。青霉素的缺点是对酸不稳定，不能口服，排泄快，对革兰氏阴性菌无效。青霉素经过扩环后，形成头孢菌素母核，成为半合成头孢菌素的原料。2. 如何根据青霉素生产菌特性进行发酵过程控制？青霉素在深层培养条件下，经历7个不同的时期，每个时期有其菌体形态特性，在规定时间取样，通过显镜检查这些形态变化，用于工程控制。第一期：分生孢子萌发，形成芽管，原生质未分化，具有小泡。第二期：菌丝繁殖，原生质体具有嗜碱性，类脂肪小颗粒。第三期：形成脂肪包
2、含体，积累储蓄物，没有空洞，嗜碱性很强。第四期：脂肪包含体形成小滴并减少，中小空泡，原生质体嗜碱性减弱，开始产生抗生素。第五期：形成大空泡，有中性染色大颗粒，菌丝呈桶状。脂肪包含体消失，青霉素产量提高。第六期：出现个别自溶细胞，细胞内无颗粒，仍然桶状，释放游离氨，pH上升。第七期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。一到四期为菌丝生长期，三期的菌体适宜为种子。四到五期为生产期，生产能力最强，通过工艺措施，延长此期，获得高产。在第六期到来之前发束发酵。3. 青霉素发酵工程的控制原理及其关键点是什么？控制原理：发酵过程需连续流加葡萄糖，硫酸铵以及前提物质苯乙酸盐，补糖率是最关键的控制指标，不同时期分段控制
3、。在青霉素的生产中，及时调节各个因素减少对产量的影响，如培养基，补充碳源，氮源，无机盐流加控制，添加前体等；控制适宜的温度和ph，菌体浓度。最后要注意消沫，影响呼吸代谢。4. 青霉素提炼工艺中采用了哪些单元操作？ 青霉素不稳定，发酵液预处理、提取和精制过程要条件温和、快速，防止降解。提炼工艺包括如下单元操作：预处理与过滤：在于浓缩青霉素，除去大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，便于后续的分离纯化过程。萃取：其原理是青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素易溶于水。脱色：萃取液中添加活性炭，除去色素，热源，过滤，除去活性炭。结晶：青霉素钾盐在乙酸丁酯中溶解度很小，在乙酸丁酯萃取液中加入乙酸钾-乙醇溶
4、液，青霉素钾盐可直接结晶析出。氨基酸发酵工艺1. 如何对谷氨酸发酵工艺过程进行调控？发酵过程流加铵盐、尿素、氨水等氮源，补充NH4+；生物素适量控制在2-5g/L；pH控制在中性或微碱性；供氧充足；磷酸盐适量。2. 氨基酸生产菌有什么特性，为什么？L-谷氨酸发酵微生物的优良菌株多在棒状杆菌属、小短杆菌属、节杆菌属和短杆菌属中。具有下述共同特性：细胞形态为短杆至棒状；无鞭毛，不运动；不形成芽孢；革兰氏阳性；生物素缺陷型；三羧酸循环、戊糖磷酸途径突变；在通气培养条件下产生大量L-谷氨酸。3. 生物素在谷氨酸发酵过程中的作用是什么？生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。生物素缺陷型菌
5、种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分之一。因此，磷脂的合成量也相应减少，这就会导致细胞膜结构不完整，提高细胞膜对谷氨酸的通透性，解除其对谷氨酸脱氢酶的抑制，源源不断生产谷氨酸。维生素发酵生产工艺1. 比较分析现行维生素C的两种生产工艺过程及本质区别，有什么优势？现行的维生素c生产工艺过程有：莱氏化学合成法和两步发酵法。莱氏化学合成法：D-葡萄糖为原料，进过催化氢化生成D-山梨醇，然后生物氧化转变为L-山梨糖，酸性液中丙酮化，对-二仲醇进行保护。L-山梨糖高锰酸钾在碱性溶液中氧化为二丙酮-2-酮-L-古龙酸，除去丙酮，内酯化和烯醇化得到L-抗坏血酸。整
6、个合成过程必须保持第4位碳原子的构型不变。两部发酵法：催化氢化：催化氢化D-葡萄糖，控制压力，在氢做还原剂、镍做催化剂的条件下，将醛基还原成醇基，从而制备D-山梨醇。第一部发酵：D-山梨醇C2位羟基氧化为羰基，其他基团不变，微生物转化得L-山梨糖。第二部发酵：L-山梨糖到2-酮基-L-古龙酸需要将C1位醇基氧化为羧基，保持其他基团不发生变化。其中两步发酵法更具有优势。原因如下：以生物氧化代替化学氧化简化了生产工艺。省略了丙酮化反应步骤，节省了丙酮、硫酸等大量化工原料和其防爆设备，节约了成本，有利于安全生产。三废和污染较小。提高了生产能力。2.维生素C的生产工艺中，手性中心是如何实现的？维生素C
7、分子中含有两个手性碳原子，故有四个光学异构体。其中L(+)-抗坏血酸括性最高，D（-）-异抗坏血酸活性仅为其20，工业上将其作为食品抗氧剂。D(-)-抗坏血酸和L(+)-异抗坏血酸几乎无活性。3. 在未来，一步发酵能取代两部发酵，成为维生素生产的主流工艺吗，为什么？一步法发酵对工业菌株的山梨醇/糖旁路代谢途径进行敲除。与原始菌株比较，发现单菌发酵24h后，培养基中剩余的山梨醇糖含量基本保持恒定，NSR缺失株相对于原始菌株残糖量提高了85.9%。基因工程制药工艺1. 工程菌与宿主菌对培养基要求有何不同，为什么？碳源：大肠杆菌以蛋白胨等蛋白质的降解物作为碳源；酵母利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质为碳
8、源。氮源：不同工程菌对氮源利用能力差异大，具有很高的选择性。大肠杆菌利用酵母粉等大分子有机氮源；酵母利用氨基酸为氮源。选择剂：基因工程大肠杆菌含有抗生素抗性基因，抗生素作为选择剂；基因工程酵母菌常用氨基酸营养缺陷型。2. 影响工程菌培养工艺的主要参数是什么？如何优化控制？温度：生长与生产温度不一致。较高温度表达量大，易形成包涵体。策略：较低温度下有利于表达可溶性蛋白质。对于热敏感的蛋白质，高温会降解破坏。策略：生产期可采用先高温，然后低温，变温表达，避免蛋白质降解。pH：了解发酵过程中各个阶段的适宜pH以后，进一步设法控制pH在合适的范围内。 分阶段控制pH：根据试验结果来确定生长最适pH和产
9、物最适pH，以达到最佳生产。 溶解氧：从供应量和需要量（菌体生长、质粒稳定性、产物积累）二个方面考虑，使之需氧不超过设备的供氧能力，在临界溶解氧浓度之上。3. 诱导物对生长和产物合成有何影响，为什么？诱导物用来诱导表达型工程菌。在细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。适宜的诱导时间非常重要。诱导物的浓度及其发酵温度会影响表达量和产物存在形式。化学诱导型启动子：lzc、tac、T7等，诱导时间为对数生长期。温度诱导型启动子：PL、PR等，诱导时间为对数期或稍后一些。基因工程制药工艺1. 什么是基因工程菌，工程菌构建的基本过程和各阶段的主
10、要任务是什么，所涉及基因工程原理是什么？将目的基因导入细菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌称为基因工程菌。工程菌构建的基本过程如下：目标基因克隆（PCR、文库筛选、化学合成）表达载体构建（酶切、链接）遗传转化与筛选（外源基因导入与培养）工程菌（获得新形状、功能、产生物质）酶切：在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。（DNA+缓冲液+限制性内切酶；37，1小时；加热、加EDTA终止；电泳检查酶切完整性）链接：DNA双链上相邻的3羟基和5磷酸基团共价结合形成3-5磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来。（载体片段和基因片段，缓冲液，连接酶；16-26，数小时；70
11、加热10min终止反应）转化：把外源基因导入宿主细胞的过程。（氯化钙法向大肠杆菌导入外源基因）2. 目标基因克隆的主要方法有哪些？分析其特点及其适用范围PCR扩增。优点：简便快速，高效，数kb单基因克隆。缺点：DNA聚合酶活性和保真性限制。（94变性55退火72延伸94变性）文库筛选。优点：长片段，无碱基错误，位置序列基因克隆。缺点：繁琐，过程复杂，耗时，昂贵。化学合成：简便，准确，已知序列基因克隆，引物合成。缺点：受合成仪性能限制，长度很短。3. 大肠杆菌中高效表达蛋白药物着重设计哪几个方面？为了确保工程菌构建的有效性，必须遵循GMP及其有关生物制品研究技术指导原则，做好菌种的记录和管理。表
12、达载体，详细记录表达载体，包括基因的来源、克隆和鉴定，表达载体的构建、结构和遗传特性。宿主细胞:详细记录宿主细胞的资料，包括细胞株系名称、来源、传代历史、鉴定结果及基本生物学特性等。目标基因序列:目标基因的序列包括插入基因和表达载体两端控制区的核苷酸序列，以及所有与表达有关的序列，做到序列清楚。重组人干扰素生产工艺1. 重组人干扰素生产工艺路线有哪几条，有何缺点？体外诱生干扰素制备工艺：仙台病毒诱导人白细胞：血浆人白细胞（病毒诱导）分离纯化人白干扰素。缺点：产量低，1g IFN需要105L人血白细胞，来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵，潜在的血源性病毒污染的可能性。Namalva细胞培养（病
13、毒培养）合成干扰素分离纯化多压型混合干扰素。优点：首次实现大规模商业化生产，用细胞培养8000L。缺点：活性低，退出临床应用。工程菌构建发酵培养包涵体复性重组人干扰素。工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。缺点：生物合成、纯化及制剂阶段均使用了一些动物或人血液提取成分，仍然没有摆脱潜在的传播血源性疾病的危险。工程细胞系构建细胞培养收集培养液分离纯化重组人干扰素。工艺特点：分泌表达，产量低，成本高，过程控制严格。可以做到无血清培养。 基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺。工艺特点：发酵周期短：几个小时，无需变性、复性过程，获得有活性产品，纯化过程：淘汰抗体亲和层析，制剂中采用非人血清白蛋白新型保护剂
14、，使得整个制造过程中不使用任何血液提取成分。2. 重组人干扰素发酵工段的关键控制点是什么，如何实现最优化过程控制？摇瓶培养：摇瓶培养：30，pH7.0，250rpm，16-20h；种子罐培养：接种：接入50L种子罐，接种量10%培养：30，pH7.0控制：级联调节通气量和搅拌转速。3. 干扰素纯化工艺的原理是什么？基于蛋白质的电荷性除去杂质，准确控制缓冲液和上样液的pH及电导值，纯化干扰素4. 干扰素纯化工艺过程中各工段的目的是什么？ 溶解粗干扰素：配置缓冲液（超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45m滤器和10ku超滤系统，百级层流下收集），冷却至2-10。在均浆器中完全溶解粗干扰素。 等点沉
15、淀与疏水层析：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液（含有人干扰素）。用NaOH调节上清液pH7.0，并用5M NaCl调节溶液电导值180ms/cm，上样，进行疏水层析，利用干扰素的疏水性进行吸附。在2-10下，用0.025M磷酸缓冲液（pH7.0）+1.6M NaCl进行洗涤，除去非疏水性蛋白。用0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）进行洗脱，收集洗脱液，干扰素。 或等电点沉淀与盐析：磷酸调节pH4.5，调节电导值40 ms/cm，2-10静置过夜，除杂蛋白。1000ku超滤膜过滤，除去大蛋白。调整溶液pH8.0，10ku超滤膜，0.005M缓冲液。 阴离子交换层析与浓缩：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂，盐浓度线性梯度550ms/cm进行洗脱，2-10，配合SDS-PAGE收集干扰素峰。把目标馏分合并，调整溶液pH和电导值，10ku超滤膜，0.05M醋酸缓冲液（5.0）中透析。 阳离子交换层析与浓缩：用0.1M醋酸缓冲液（pH0.5）平衡树脂。上样，相同缓冲液冲洗。盐浓度线性梯度5-50ms/cm进行洗脱，配合SDS-PAGE收集干扰素峰。合并馏分，10ku超滤膜系统。 凝胶过滤层析：0.15M NaCl的0.01M磷酸缓冲液（p
