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1、芪丹通脉片对大鼠海马部分缺血及HSP70蛋白表达的影响王冰，王宗仁，王洪典，江山，李锋，马静，行利【关键词】芪丹EffetfQDTTnexpressinfHSP70inhippapusfratsithfalerebralisheia【Abstrat】AI:TstudytheeffetfQidantngaiTablet(QDTT)nratsithfalhippapalinfartin.ETHDS:SeventytaleSDratsererandlydividedint6grups(n=12):ntrl,shaperated,isheia,QDTTfhighdsage(QDTTH),QDTTfde
2、ratedsageQDTT)andQDTTfldsage(QDTTL).TheratdelsereprduedbyphtheialethdsandtheexpressinfHSP70aseasuredbyiunhistheistryafterthepathlgialanalysis.RESULTS:ThepathlgialhangesdereasedinratstreatedbyQDTTparediththseinntrlgrup.HSP70psitiveellsinQDTTtreatedgrupsererethanthseinntrlgrup:isheiagrup(233,QDTTH(898
3、,QDTT(786),QDTTL466(P0.01).NLUSIN:TheneurprtetiveeffetfQDTTayberelatedithitsupregulatinfHSP70intheratbrainafterfalerebralisheia.【Keyrds】QidantngaiTablet；braininfartin;hippapus【摘要】目的:讨论芪丹通脉片(QDTT)对大鼠海马部分梗死的影响和机制.方法：雄性SD大鼠72只，随机分为6组n=12，即空白对照组、假手术组、缺血组、高剂量组H，中剂量组，低剂量组L.采用光化学法诱导大鼠单侧海马梗死模型,对缺血脑组织进展病理形态学
4、分析及HSP70免疫组化.结果：QDTT各给药组缺血灶内HSP70表达明显高于缺血组：缺血组233，H组898，组786，L组466P0.05.结论：QDTT能减轻大鼠海马部分脑梗死损伤程度，可能与上调HSP70表达有关.【关键词】芪丹通脉片;脑堵塞；海马0引言脑缺血后HSP70在鼠脑中的表达具有神经保护作用，药物的干预等因素能影响HSP70在缺血性脑损伤细胞中的表达.我们通过光化学法诱导的海马部分梗死模型，观察芪丹通脉片对缺血大鼠脑组织病理形态学及HSP70表达的影响，并对其脑保护机制进展了讨论.1材料和方法1.1材料SD雄性大鼠72只,体质量(20020)g第四军医大学实验动物研究中心提供
5、.芪丹通脉片QidantngaiTablet，提取浸膏干粉西京医院提供，加生理盐水配制成混悬液.虎红四氯四碘荧光素钠粉剂,RB,北京化工厂，批号：810627,密封避光保存，使用前用生理盐水稀释为25g/L.自制冷光源(西京医院理疗科和西安飞秒光电集团结合研制)，光源为一充气氙灯，输出功率：IN0.008/2,AX0.37/2，输出波长490550n，波峰530n,输出端连一直径0.6的石英光纤.1.2方法1.2.1海马局灶性缺血模型制备动物随机分为6组,每组12只，分别是空白对照组、假手术组、缺血组、H组(3.24/)，组(1.08/),L组(0.36/).大鼠用10g/L戊巴比妥钠30g/
6、kg腹腔注射麻醉后，将其俯卧于脑立体定位仪上，沿头颅正中切开头皮暴露颅骨，在前囟后4.8、中线向左旁开3.6处，用牙科钻轻轻钻一个直径约1的骨窗，光纤管尾端至皮层下3.1海马区.于尾静脉注射25/L虎红70g/kg后，立即通过光纤管照射30in.光照强度：0.37/2.术后缝合头皮，正常喂养.假手术组尾静脉注射等体积生理盐水后光纤插入照射.各剂量组于术后当日以10L/kg灌胃溶液1k，1次/d.缺血组及假手术组用等体积生理盐水替代灌胃，余同中药治疗组.1.2.2取脑固定术后第8日，将各组大鼠麻醉后开胸暴露心脏，经主动脉，先用生理盐水100L迅速冲洗血液，再用40g/L多聚甲醛400L灌注固定2
7、h,取脑在4下进展后固定.1.2.3观察病理改变每组取6只鼠脑，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，经缺血处连续切片，片厚5,每隔50取1片，HE染色，光镜下观察组织病理学改变.每只鼠脑取经缺血灶中心5张切片，光镜下1010计数每张切片缺血灶内缺血神经细胞数.经海马部位取材33大小组织块，30L/L戊二醛前固定，10g/L锇酸后固定，0.1l/LPBS漂洗、丙酮梯度脱水,丙酮包埋剂(11)浸透,环氧树脂包埋及修块,超薄切片后,1200透射电镜下观察.1.2.4免疫组化分析每组取6只鼠脑，200g/L蔗糖脱水至沉底，冰冻切片机经梗死部位进展30厚连续冠状切片.取缺血灶一样层面脑片做HSP70免疫组化AB法染
8、色.主要步骤如下:切片经0.01l/LKPBS漂洗310in后入含30g/LTritnX100的KPBS30in;经12000小鼠抗HSP70血清(Siga)室温摇床孵育24h;再经生物素化的抗鼠IgG(1500,Santa)抗血清室温2h;AB液(1500,Santa)室温2h;DAB葡萄糖氧化酶法呈色,常规贴片、枯燥、脱水透明、封片.每步骤后均用0.01l/LKPBS(pH7.4)充分洗涤.对照脑片以KPBS替代一抗.取每只鼠脑经缺血灶的5张脑片，在光镜下1010计数阳性细胞数.计算出每组6只大鼠的免疫染色阳性细胞数.统计学分析:数据以xs表示,用SPSS统计软件进展方差分析，并用SNK方
9、法进展组间两两比拟.2结果2.1病理改变和缺血神经细胞数比拟光镜下可见，片状缺血灶区神经元肿胀、细胞核固缩深染，胞质嗜伊红性增强呈粉红色.缺血侧组织空泡化.在堵塞核心区部分神经元消失,残存的神经元严重变性,呈不可逆性.各组缺血神经细胞较缺血组少，假手术组几乎无缺血损伤.电镜结果可见，正常对照组神经元细胞形态完好,可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和线粒体;线粒体嵴明晰,排列规那么;核膜明晰,核内染色质以常染色质为主,核仁明显，微管、神经丝排列整齐;突触构造正常;毛细血管内壁光滑，内皮细胞构造完好，明晰.模型组坏死中心区构造崩解严重，胞核染色质崩解，核溶解，仅见少量残存细胞器，细胞轮廓消失；在坏死
10、周边部位，神经细胞核空泡化，核内异染色质增多，凝聚呈块状，边集明显；线粒体空泡化明显，嵴消失；微管、神经丝排列紊乱；毛细血管轮廓存在，内皮细胞消失，呈凝固性坏死改变(图1A).QDTT各组神经元电子密度增高，核膜明晰,核内异染色质稍增多,核周间隙较狭窄；胞质内细胞器较明显,但内质网和线粒体均有水肿样改变,线粒体电子密度低,嵴减少,粗面内质网脱颗粒并扩张呈不规那么泡状,高尔基体扩张，存在髓鞘样构造和少量紫褐素颗粒，毛细血管管周轻度水肿图1B.A：缺血组；B：给药组.图1芪丹通脉片对大鼠海马部分缺血病理构造的影响TE120002.2HSP70免疫组化分析缺血组阳性细胞表达最少，中药治疗组阳性细胞表
11、达数增多，各剂量组间比拟有差异，假手术组未见表达(表1，图2.表1各组大鼠缺血神经细胞及HSP70免疫阳性细胞数比拟略图2芪丹通脉片对大鼠海马部分缺血HSP70表达的影响253讨论缺血性脑血管病属祖国医学中风范畴,正气虚弱，肝肾亏虚，痰瘀阻滞为其主导病机.中医主要以益气活血、养血通窍等方法辨证论治.临床上活血化瘀复方制剂被广泛用于治疗缺血性脑血管疾病.现代中医学认为，血瘀证涵盖血液循环障碍、血栓形成、血小板活化黏附聚集、组织增生变性、炎症、动脉粥样硬化及生物活性因子调控异常等诸多病理改变.活血化瘀的作用不仅表现为改善血液的流动性和血液黏度，降低血小板活化黏附聚集，抑制平滑肌细胞增生及其某些方面
12、相关基因、蛋白的调控表达等，还包括影响血液循环的神经、体液调节及免疫功能等.QDTT是在气血相关理论指导下制成的纯中药复方制剂，主要由黄芪、丹参、当归、红花、桂枝组成.其中,黄芪与桂枝益气通阳，丹参、红花活血化瘀，当归养血活血.现代药理研究证明，黄芪活性成分黄芪皂甙能改善细胞能量代谢，抑制血小板聚集，进步细胞内超氧化物歧化酶活性.丹参所含丹参素具有抗缺血、抗自由基、抑制细胞内游离钙离子浓度升高等作用，当归和红花可改善微循环，桂枝有促进纤溶等作用.该药在既往实验研究中被证实，可以改善血流变浓、黏、凝、聚状态，保护缺氧状态下细胞线粒体构造,减轻氧自由基对细胞膜的损伤，具有抗血栓形成，保护血管内皮细
13、胞等作用1-2.神经元调亡是脑缺血后迟发性神经元损伤的重要机制之一.HSP70蛋白表达与缺血引起的海马区迟发性神经元损害关系亲密.HSP70合成增加可防止蛋白质聚集.它一方面阻止诱导调亡的因素起作用，另一方面保护染色体，防止参与调亡的蛋白酶和核酸攻击，阻止细胞开启自杀途径，减轻了细胞调亡.本实验说明，对光化学法大鼠脑部分缺血损伤有保护作用.大鼠部分缺血造模后，各给药组病理改变均较缺血对照组轻，且上调了HSP70蛋白表达.轻度脑缺血损伤即可诱导HSP70表达，中度缺血可诱导转录，但不翻译，重度缺血时它只在梗死边缘区表达3-4.本实验也观察到，中药治疗各组在缺血区和皮层等远隔区域有大量HSP70阳
14、性细胞表达，而缺血组仅在坏死周边区域有少量表达.可能通过改善脑缺血部分微循环，促进HSP70蛋白表达，增强脑组织的修复才能.【参考文献】1王宗仁,马静,行利，等.芪丹通脉片对大鼠心肌线粒体损伤的保护作用J.第四军医大学学报，2022，245：400-402.2魏立强,王宗仁,王琳，等.芪丹通脉片对大鼠血管内皮细胞损伤的保护作用J.第四军医大学学报，2022，264：321-324.3GiffardRG,YenariA.anyehanissfrhsp70prtetinfrerebralisheiaJ.Neursurgery，2022，53(1):186-191.4LeeSH,KnH,KiYJ,etal.Effetsfhsp70.1geneknkutntheithndrialappttipathayafterfalerebralisheiaJ.Strke，2022,35(9):2195-2199.
