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1、第1章 文献综述1.1. 引言高效液相色谱（HPLC）作为分析化学中复杂体系分离分析的重要手段之一，在许多领域都有着广泛的应用。蛋白质组学1-4、中药1-3、聚合物4-6、环境7和药物8等复杂体系的分离分析为各种色谱技术的发展带来了机遇和挑战。蛋白质组学和中药等研究中样品体系极其复杂，采用传统的一维分离模式所能提供的分辨率和峰容量难以满足高效分离与高灵敏检测的要求9, 10。Gidding等11指出，当样品中的组份数超过系统峰容量的时，样品在系统中便得不到良好的分离。对于随机分布的样品，完全分离其中98%的组份，系统的峰容量需要是样品中组份数的100倍以上12，采用一维液相色谱进行分离时，分离
2、500个峰需200万理论塔板/m（分离度1.5）的柱效13。显然，我们不能寄希望于一维色谱分离能力能提高几个数量级14，因此，只能采取其他方法，如多维色谱分离系统。多维色谱技术的历史可以追溯到1944年，Martin和同事利用纸色谱法15，在两次分析中，将流动相以直角的方式洗脱样品，第一次实现了二维的高效分离。近年来，色谱工作者把主要的精力放在使用现代柱色谱技术代替薄层技术上。柱色谱技术的优点包括重现性、速度、选择性和易用性，重要的是，柱色谱易于与其他检测技术相连，如质谱。1978年，Erni和Frei16设计出了阀切换系统，构建了GPC/RPLC模式的二维色谱。由于采样不足（切阀时间长达75
3、 min），分离度有限，同时没有自动化的阀配置和数据转换过程，没有给出二维色谱图，因此并没有引起重视。1987年，J. W. Jorgenson受J. C. Giddings的启发，开始研究复杂样品分析实用的多维色谱方法。1990年17， Bushey和Jorgenson改进了Erni和Frei的装置，构建了IEX/SEC二维系统，通过降低采样时间到6 min，以及协调两维间的流动相梯度和流量，实现了较高的正交性分离，并第一次以3D图的方式展现出来，实现了蛋白质的全二维分析，第一次展现了多维色谱的巨大优势。为了与传统的“中心切割”方法相区别，Jorgenson将他命名为“全二维（compreh
4、ensive）”，以表示该方法包括了样品的全部信息18。全二维的另外一个进展是与质谱检测联用。Opiteck等在所构建的IEX/RP19和SEC/RP20系统中，首次将电喷雾质谱和UV与二维系统在线联用进行蛋白质和多肽鉴定。将NP与RP联用被认为是正交性最好的系统，但由于流动相兼容性不好，一直难以实现。Murphy等4首次将正相与反相联用，通过使用水为正相流动相，避开了流动相兼容的难题。Dugo等21第一次实现真正意义上的NP/RP分离，通过第一维使用二醇基微柱并且在低流速下运行（20 L/min），而第二维使用C18整体柱在高流速下运行（4 mL/min），十通阀连接两个定量环，每分钟切割一
5、次，实现了柠檬油的正交性分离。Francois等22改进了系统，添加了二维泵、色谱柱和检测器，更重要的是添加了一个十通阀23，使得第二维以平行柱模式运行，分析时间2 min，大大降低了第一维流动相对第二维分离的干扰，实现了更高的峰容量。另外一种构建NP/RP二维系统的装置是在接口处将不兼容溶剂蒸发去除。关亚风课题组3, 24, 25使用了真空辅助溶剂挥发接口去除馏分中的溶剂；Francois26使用超临界流通色谱（SFC），流动相为超临界的二氧化碳，降低压力后直接挥发去除。Carr课题组提出了以高温色谱和高线性流速进行洗脱以加快第二维的分离速度7, 27, 28。以十通阀连接两个定量环，通过将
6、第二维分离温度升高到110 C，第二维梯度洗脱时间仅21 s，二维分离总时间仅需20 min，而峰容量高达1350，相当于一个峰容量单元仅占1 s。全多维液相色谱技术蓬勃发展，2006年以后发表的综述类文献就有43篇6, 9, 10, 27, 29-68。多维色谱具有足够高的峰容量和高选择性为解决复杂体系分离问题提供了有效工具，并已在蛋白质组学研究、环境样品的分析、中药研究、生物医药16，17及烟草分析18等方面得到广泛应用。本章将从多维液相色谱理论、二维液相色谱系统、接口技术、联用方式及应用等方面对近年液相色谱的最新进展进行综述。1.2. 二维液相色谱的峰容量、正交性和采样频率特征早在196
7、7年，Giddings69就提出了描述等度峰容量的公式。Giddings等指出，在各维色谱分离模式完全不相关的条件下，多维色谱的总分辨率等于各维分辨率平方和的平方根，总的峰容量等于各维峰容量的乘积。与一维色谱相比，多维色谱的分辨率和峰容量有了极大的提高。理论上，多维液相色谱系统可以组合的分离模式的数目即系统的维数并没有限制。但实际应用中受仪器成本、操作复杂性、检测池体积和检测器选择性等因素的制约，目前所报道的多维液相色谱基本上为二维液相色谱（2D-LC）。二维液相色谱(2D-LC)是将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统。样品经过第一维色谱柱分离后进入切换接口中，通过接口
8、的富集、浓缩以及切割后进入第二维色谱柱继续分离。基于 Giddings70的理论，Schoenmakers71定义全多维液相色谱模式（Comprehensive Multidimensional LC）应满足3个条件：（1）样品的每一部分都受到不同模式的分离；（2）所有样品组份以相等的比例（100%或稍低一些，即并不要求100%分析物，只要分流的部分能代表所有样品组份信息即可）转移到二维及检测器中；（3）在一维中已得到的分辨率基本上维持不变。“基本”指通过测量全二维中第一维轴上的某个特殊峰所对应的第一维的分辩率与一维情况相比减少不超过10%。其中，第一条和第三条说明了传统的中心切割技术与全二维
9、的区别。Schoenmakers 等认为在二维分离之前进行分流也可称为全二维分离，进一步拓宽了全二维分离的概念。1.2.1. 峰容量使用二维色谱技术的直接原因是增加峰容量。峰容量72是指在两次保留时间之间，按一定分离度所能放置的峰的个数。起初，峰容量用来描述分离系统中所能容纳色谱峰的个数，此时的峰是规则的，即峰的保留时间是倍数关系，因此，峰间距是常数。然而，峰容量由峰宽决定，而峰宽与塔板数和分离度有关，多数分离技术中实际分离的峰宽是随机的，因此，实际峰容量与理论不符。峰容量nc的概念是由Giddings69提出的，与塔板数与塔板效率相比，峰容量提供了对分离性能的更为通用的估计。等度分离时，Gr
10、ushka73给出的峰容量公式为：11LC等度分离时的峰宽并不是恒定的，梯度洗脱条件下，可以认为峰宽是常数74。则峰宽可以表示为：12一维色谱中，恒定的峰宽具有更大的峰容量，二维色谱也是如此。一个简单直观的峰容量计算可以由保留时间除以峰宽得到，即：13这个公式在讨论实际样品峰容量75时较有效，因为它是根据色谱图上时间峰的数目计算的，而不受限于一维或多维技术。尽管如此，由于峰的随机分布，实际谱图上的色谱峰数目总是小于计算的数目。针对特定的应用，峰容量的确有许多报道。Wang等人76尝试了多肽分离的峰容量的优化与计算，而Wren77则针对超高效液相色谱（UPLC）中的梯度分离专门讨论了这个问题。N
11、eue78最近综述了在等度LC、尺寸排阻（SEC）LC、多肽梯度分离等方面计算峰容量的不同方法。Guiochon14讨论了1D-LC分离中测定峰容量的局限性。计算峰容量的大量的理论和方程表明，尽管分析界认可峰容量计量学（peak capacitymetric）是该领域的迫切需求，然而选择一种可以在不同研究之间进行比较的合适的近似方法是很困难的。Guiochon等79-81详细计算了2D和3D峰容量，显示出了多维色谱巨大的峰容量优势，并指出这个优势可以解决峰重叠的问题。Giddings提出82多维色谱峰容量的计算可以由单维色谱峰容量的乘积估算：14由单个色谱峰容量乘积而得到的总峰容量，显示出了这
12、种分离方式的巨大优势，这也在某种程度上促进了使用柱色谱技术代替薄层色谱，也直接导致了全二维色谱的诞生。实际二维峰容量通常低于（4）式所得的预测值，这取决于两维之间的相似度，因为该值包含一个两维间保留相关性的区间。在计算实际的2D-LC峰容量时，需要对一些相互影响的因素进行评估，包括正交性和采样频率。如果2DLC中使用的两个色谱柱在分离机理上有一定的相关性，则峰容量低于乘法所得到的数目。另外，如果第二维不能够完全采集第一维色谱流出的样品，则峰容量也没有完全利用7，由采样造成的峰容量局限近来由Tanaka83提出。峰容量的值并没有给出产生这些峰所花费的时间。色谱理论中，每单位时间所产生的峰容量常用
13、来表示此项技术的效率，Grushka84在1984年实现了这方面的要求。Carr85在2DLC中使用梯度洗脱，在25min内产生了900的峰容量，即峰宽为2s。实际峰容量计算的不同策略严重阻碍了不同小组之间分析结果的比较，多维（MD）分离性能很容易有意或无意地高估，峰容量一般过高。因而，在将来的全二维液相色谱（comprehensive LC）领域，通过由专家们取得一致同意的基础上，提出一些约定或惯例，从而建立一种简单方法。另一方面，峰容量的概念在分析化学中是通用的49，例如，样品可以在时间维度上分离，即柱色谱，也可以在空间维度上，即薄层色谱。同样，质谱可以在空间维度上分离样品，如使用四极杆质
14、量检测器，依照质荷比分离，也可以在时间维度上分离样品，如使用飞行时间质量检测器，样品到达检测器的时间与质荷比有关。因此，当考虑到检测器本身的维度时，分离的维度可以进一步增加。Russell86使用IM-MS检测器分离多肽时测得峰容量约2600，如果这种技术与2DLC正交，则联用可产生近一百万的峰容量。Merenbloom87将IM-MS以二维的方式连接，构建了2D-IMS系统，峰容量仅有480-1360，远远低于一维的容量。Frahm88考察了FT-ICR与质谱相连用于蛋白质组的研究。峰容量的概念可以用于所有质谱检测，如果质谱与色谱正交，则可以将MDLC与MS峰容量乘积，获得巨大的峰容量。Le
15、wis89、Shen90和Valentine91等在LC-MS和2DLC-MS分析中提到了质谱的峰容量，但都没有严格测量。峰容量的概念也可以用于DAD，尽管这种多波长的紫外检测器可以通过化学计量学的手段将重叠峰分开，但所提供的峰容量不如MS多。即使只有2倍的峰容量，DAD检测器与化学计量学技术相连时仍具有一定的优势。1.2.2. 正交性在LCLC系统中，两维之间的正交性是非常重要的。通常，如果采用的两种分离机制是互相独立的并且具有完全不同的保留曲线，或者说具有不同的选择性，则认为该2D分离是正交的12, 92-94。正交性的概念和含义如图1(a和b)所示，并以NP-LCRP-LC（图1c）和RP-LCRP-LC（图1d）分别分离柠檬油和类固醇为实例作为说明。从图1a可观察到低相关性（高正交性），其中，样本随机地分布在整个分离空间，而图1b中则显示出高的线性相关性。在这种情况下，增加额外分离维数的结果是除增加了系统的复杂性外没有任何实际意义。从技术角度来说，真正意义上的正交很难实现，因为正交性不仅取决于分离机制，而且依赖于溶质的性质以及分离条件。实际上由于溶质的本性有别于样本来源，因此没有通用的正交组合。当根据样品中成分的物理化学性质如尺寸、电荷、极性、疏水性等选出恰当的固定相和流动相后，才有可能构建出比较成功的正交组合。目前，可以得到多种多
