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1、实验设计ELISA检测AFP试验精密度的评价一、原理： 采用双抗体夹心一步法：用纯化的甲胎蛋白（AFP）抗体包被微孔板，制成固相抗体，在向微孔中同时加入AFP与酶标抗体，经过一次温育，然后彻底洗涤，加入底物TMB并避光显色，TMB底物经HRP催化反应为蓝色物质，使溶液呈现蓝色，加入强酸（H2SO4）终止剂后，溶液呈黄色，其颜色（黄色）的深浅与AFP浓度呈正相关。 用酶标仪在主波长为450nm,次波长为630nm下,lOmin内测定各孔吸光度A0ELISA的精密度可用其反义概念不精密度来表示，不精密度可用标准差（S）和变异系数（CV）反映：曲沖5皿凶幺巨A2工（A/n宀IiIi（i.S=I=3亠
2、-n1n1CV=A二、仪器和试剂：试剂：高浓度的（400ng/ml）AFP血清1.5ml，低浓度（20ng/ml）AFP血清1.5ml，蒸馏水，（AFP）ELISA试剂盒（酶联板、HRP标记的抗AFP抗体、AFP阴性对照试剂、AFP阳性对照试剂、TMB显色液、浓缩洗涤液、终止液、封板膜）。仪器：酶标仪、微量加样枪及配套吸管、刻度吸管（2ml）、恒温水浴箱、洗板机、吸水纸、消毒缸、剪刀、洗瓶、记号笔、洗耳球。三、试验方法：1、微孔编号：阳性对照孔：A1、A2，阴性对照孔：A3、A4、A5和空白孔A6，高浓度血清加样孔为：A7-C2，稀释血清稀释液加样孔为：C3-D10。2、加样：向阳性对照孔、阴
3、性对照孔分别加入阳性对照试剂、阴性对照试剂各50ul，空白孔不加任何试剂，向A7-C2中各加入高浓度血清各50ul、向C3-D10加入低浓度血清液各加入50ul，并向每孔中加入酶标AFP抗体50ul，空白孔不加，轻轻震荡混匀。4、温育：用封板膜进行封板，将微孔板置于37C恒温水箱温育30min.5、洗涤液的稀释：将浓缩洗涤液用蒸馏水进行20倍稀释后备用。6、洗涤:取出微孔板，揭去封板膜弃去液体,向每孔中加满稀释洗涤液然后浸泡30-60S,弃去洗涤液，如此重复5次后拍干。7、显色：每孔中依次加入显色剂A、显色剂B各50ul,室温避光显色5min。8、比色测定：每孔中加入终止液50ul，轻轻震荡混
4、匀，在阴性对照孔为无色，阳性对照孔为黄色，空白孔为无色的情况下,设定酶标仪主波长为450nm、次波长为630nm对每孔进行吸光度A的测定，并进行记录。吸光度值123456789101112ABCD四、结果判断：阴阳性对照孔可用，则阳性为黄色，空白对照孔、阴性为无色，样品孔呈黄色。此时可利用样品孔对ELISA进行精密度的评价。五、实验结果计算和统计学处理：工A2_A1+A2+A3+A18+A19+A20A=Scv=A分别计算出平均值、标准差和变异系数并进行精密度的评价。六、质量控制：1、实验必须设置阴阳性对照和空白对照从而保证实验的可信性和质量。2、试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分
5、钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。3、样品：样品应用已知的浓度的样品，避免AFP浓度过咼而超出ELISA最咼检测限、血清稀释时要足够稀释。4、加样：要使用正确的加样技术，使加样枪的洗头稍高于微孔的平面，不能触及微孔板和微孔中的液体，而且不能将液体溅出微孔外、加样枪必须是校准过的，并且所有加样时间最好控制在5min之内。5、温育：温育时要进行膜封，封板膜应限制一次性使用；温育时应将微孔板置于湿盒内，进行温育。温育时间不能过短，避免特异性结合不够，测得值偏低，时间也不能过长，非特异性结合物紧附于微孔上，难以洗干净，使测得值偏高。6、洗板：微孔板的清洗是实验的关键，应进
6、行彻底的洗净，并拍干，但不能完全干燥。并且每个微孔的洗涤液不能溢出到另外的微孔。7、显色：显色剂必须保证没有过期，在加显色剂时要准确，避免溅出孔外，要用一次性吸头，加显色剂时间要越快越好，从第一孔到最后一孔不能超过10min。8、终止：在加终止液是不能产生气泡，剂量要准确。9、数据处理时，应去掉离散值，然后进行计算。七、注意事项和影响因素：1、所用ELISA试剂必须为同一厂家、同一批次，不同厂家和不同批次的试剂不能混合使用。2、ELISA试剂盒试剂没有变质。阴阳性对照试剂和酶标抗体可用。3、加样时不能将样品混合，每个微孔的样品试剂不能溅出到其他微孔。4、加样品时，每个孔的剂量必须一致，避免测量
7、结果的大幅度波动。5、每加一个微孔应换一次吸头，避免交叉污染和剂量的不一致。6、显色剂的量必须准确，并且次序为先加显色剂A,再加显色剂Bo7、洗涤时，必须是彻底洗净，特别是加入酶标抗体后的洗涤，那是本实验的关键步骤。8、在最后结果判断和A的测定时，前提条件是阴阳性对照可用的情况，如果阴阳性不可用，级阴阳性对照无效，则本实验无效，不能用于ELISA精密度的评价。应另外选用ELISA试剂盒。9、显色时应避光显色。显色后加入终止剂后最好立即（最好lOmin内）测定A值。10、每步加试剂后都应轻轻混匀，并且温育时间要适当，保证试剂之间的充分反映。2012级医学检验4班组长：刘警隆201246603218成员：代钟钰201246603250黎倩倩201246603238李婷201246603242王宇星201246603246廖科茸201246603230张腾华201246603222肖粲201246603234
