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1、5tep 1IDCmD5d加入肿血犁齟分离机輔T谢育、HJSlflPBMG2.詁壁法護謨单垓细胞乳 jnASM 5F（5Q0 lr0Q9Wmi)和 ii-afsoau/mi少抗原肚何选歩臨J1. TNF-ct10ng/ml|2. IL-l(104i/m)3. It-SjttSnOU/ml取 PGE2 IHng/mODC的制备方法发布时间：2015-12-07 15:03点击次数：665Monacyte皋率量挽境一紀 并补加GM$F和ILu|【背景】DC是Dendritic Cells的缩写，中文全称为树突状细胞，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样 突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加
2、拿大籍科学家Ralph M. Steinman于1973年发 现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞（Antigen Presenting Cells, ABC）已证实，DC是唯一能 够显著刺激初始T细胞（Na ve T cell）增殖的APC，而其它种类的APC （如单核巨噬细胞，B细胞 等）仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞，因此DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿 瘤免疫中发挥着极其重要的作用。【培养原理】因为DC需从其它种类细胞诱导分化而来，且可分为不同的成熟阶段，所以通常分为2个步骤进行培养：Step 1：从DC的祖细胞（如单核细胞）诱导分化为未成熟DC （immature
3、DC，iDC）；Step 2：从 iDC 诱导分化为成熟 DC (mature DC , mDC )。Step 1 :GM-CSF （粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）：GM-CSF 是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞集落的形成，并具有促进早期红 巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。GM-CSF 是最早被鉴定出对DC培养有作用的细胞因子 之一。GM-CSF 在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达 得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF 也可促进DC的存活。IL-4 （白细胞介素-4）IL-4在由单核细胞诱导成DC的
4、过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向 DC方向分化。若培养体系中不加IL-4单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面 表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。GM-CSF 和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC，此时的DC具有较强的抗原摄取和 加工能力,但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子（CD80, CD86 等），但不表达或低表达CD14。Step 2:TNF-a/IL-10/ IL-6 （肿瘤坏死因子-a/白细胞介素-10/白细胞介素-6）TNF- a, ILT
5、0和IL-6均为促炎症因子，在感染局部和肿瘤部位被诱导产生。体外 研究表明，这3种 细胞因子均可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室 （class II compartmen消失，但能够上调细胞表面MHC I类、II类分子和B7家族分子（CD80, CD86 等）的表达，使未成熟DC分化为成熟DC，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈 能力显著增强，可极强地激活T细胞。TNF- a/IL-10/IL-6三因子组合可在无牛血清培养条件下诱导DC的完全成熟，从而制备出可以应用于 临床的DC 。PGE2 （prostaglandin E2，前列腺
6、素 E2）PGE2也是炎性介质，可由TNF- a，IL-1和LPS （脂多糖）等炎症信号诱导产生。在TNF- a/IL-ip/IL-6成熟诱导组合中添加PGE2，可进一步提高DC的产量、成熟度、迁移能力和免疫 激活能力。这里尤为重要的是DC迁移能力的提高。因为TNF- a/IL-10/IL-6诱导成熟的DC迁 移能力较弱，不 能很好地到达淋巴结而激活T细胞。而添加PGE2后诱导成熟的DC因表面趋化因子受体的高表达, 而更容易迁移至淋巴结，而引起机体对抗肿瘤的免疫反应。因此，TNF- a/IL-10/IL-6/PGE2组合见下表)广泛应用于临床，并被认为是制备成熟DC的金标准组份工作浓度TNF-
7、a10ng/mlIL-1B10ng/mlIL-61000 U/mlPGE21mg/ml【注意事项】1. DC 的来源：DC有多种来源，包括外周血单核细胞(Monocyte )、脐带血CD34+细胞、骨髓和胎肝等，但因外周血 单核细胞最容易获取、数量也最多，所以临床上被广泛用作DC的来源细胞。2. DC 的成熟度：我们知道，DC有未成熟和成熟两种状态，即iDC和mDC，而DC的抗原递呈能力与其成熟状态密切 相关。iDC的抗原摄取和加工能力较强，但抗原递呈能力很弱。在体外培养时，iDC去除细胞因子(即GM-CSF 和IL-4后，会逆转为巨噬细胞，且即使在细胞因子的维持下，未 成熟DC的功能也不是激
8、活T细胞， 而是抑制T细胞的增殖。mDC 则正好相反，其抗原摄取和加工能力很弱，但具有很强的抗原递呈能力。因而可以激活T细胞， 引起免疫反应。而且DC成熟后即使在培养体系中去除细胞因子，仍能保持DC的状态和功能，不会发 生逆转。因此可以看出，DC必须完全成熟后才能用于免疫治疗。3. DC 的无牛血清培养：不能将iDC诱导成为mDC，或仅能诱导一小部分iDC成为mDC 。DC最初都是在含有小牛血清(Fetal Calf Serum, FCS )的培养体系中获得的，但我们知道，如果想将DC应用于临床治疗，则不能使用FCS。然而如果不用FCS，DC则无法培养成功。科学家最先想到的是用10%的人自体血
9、浆来替代10%的 FCS，但实验结果表明，人单核细胞在含10%人自体血浆的培养液中培养，用GM-CSF 和IL-4诱导7 天后，大多数单核细胞仍贴壁，半悬浮的iDC数量非常少。后来经过不断摸索发现，在无血清培养基 中添加1%人自体血清对于从单核细胞诱导成为iDC效果最好。更为困难的步骤是如何在无牛血清培养体 系中将iDC诱导成为mDC 。TNF- a和ILT0在含牛血清培养体系中均是很好的DC成熟诱导剂，而在 无牛血清培 养体系中，两者均无效或效果微弱，即在无牛血清清培养体系，TNF- a和IL-1后来的研究表明，用单核细胞条件培养基（Monocyte-conditioned medium，M
10、CM ），即单核细胞在包被 有免疫球蛋白的细菌平皿上无牛血清培养24小时后得到的培养上清，可在无牛血清培养体系中诱导DC 的完全成熟。因此认为，1%人自体血浆+ MCM 可能成为临床上获得成熟DC的标准方法。但每次制备的MCM的一致性很难保证，导致每批MCM 必须经过测试后才能确定最适用量，这给临床应用带来阻力和不稳定性。所以，人们一直想寻找到能够替代MCM 的化学成分明确的成熟诱导组合。1997年，德国美因茨大学（Mainz University的Jonuleit等取得了突破性进展，他们发现TNF- a，ILT0 和IL-6三种细胞因子的组合可完全替代MCM，在无牛血清培养体系中能够将iDC
11、诱导成完全成熟的 DC 。4. PGE2 与 DC：德国美因茨大学的Jonuleit在证明TNF- a，ILT0和IL-6三种促炎症因子的组合可 完全替代MCM ， 在无牛血清培养体系中能够将iDC完全诱导成熟的同时，也发现另一种炎症介质，即PGE2可进一步 提高DC的产量、成熟度、迁移能力和免疫激活能力，也就是说在TNF- a,ILT0和IL-6之外添加PGE2 可获得更为成熟和高效的DC，这样会提高临床上DC的治疗效果。PGE2常被加入DC成熟诱导组合中最重要的原因是其可提高成熟DC的迁移能力，这样可使DC更 容易到达淋巴结，从而引起免疫反应、治疗肿瘤。但我们也应该注意以下几点：1）PGE
12、2不能添加到DC诱导分化的Step 1中，如加入，DC的分化将会被抑制；2） 我们知道，能诱导机体产生Th1反应的DC （很多文献中称为DC1 ）有助于多种肿瘤，如黑色瘤 和恶性胶质瘤等的治疗。实验研究表明，在成熟诱导因子（TNF-a/IL-10）中加入PGE2倾向于将iDC诱导 成为成熟的DC2，而非 DC1，该DC会诱导产生Th2反应。所以很多人在试图寻找能够诱导DC1的最佳成熟诱导组合，如 TNF- a/IL-10/IFNa/IFN-Y/poly-I:C TNF- a/ILT0/IFN-Y/PGE2（低浓度）/R848（TLR7/8 激动剂）和 IFN-y/LPS序贯组合等，但这些新组合
13、都未得到临床上的充分验证，也就没有真正用于临床级别DC的 制备。3）其实，各家的研究结果不尽相同。比如，TNF- a/IL-ip/IL-6/PGE2组合的创立者德国美因茨大学的Jonuleit在研究时就发现，添加PGE2诱导成熟的DC在刺激T细胞时可显著 提高其分泌的IFN-y产量，而对IL-4和IL-10的分泌无影响，提示添加PGE2诱导成熟的DC具有 诱导Th1反应的倾向。总之，培养体系中是否加入小牛血清，以及所使用的无血清培养基种类不同等诸多因素都可能导致添加 PGE2诱导成熟的DC在性质上的差异，因此临床上制备DC时最好能够做充分的前期研究，然后确定 用于治疗某种肿瘤最好的制备方法。D
14、C 的制备】1. 外周血单个核细胞的采集1.1用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml1.2淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。1.3无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3 x 10&2.(可选步骤) 肿瘤抗原的制备用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TS或肿瘤相关抗原 (Tumor-Associated Antigens, TAA)也可以是肿瘤全细胞抗原。用TSA或TAA负载的DC具有很好的靶向性，但该方法具有已确定的肿瘤特异性抗原或抗原肽种类 少
15、和单一抗原的免疫攻击经常无法杀伤肿瘤细胞等缺陷。而用肿瘤全细胞抗原负载DC可克服这些缺陷, 因为此时无需知道哪些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可 诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T淋巴细胞(CTL)克隆，从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用 坏死或死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常 用的是用肿瘤细胞裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：2.1手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；2.2无菌生理盐水洗3次；2.3用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；2.4 200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；2.5用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml装入5ml无菌冻存管中；2.6将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解冻10 min。反复3-5次；注：也可以-80oC/37oC反复冻融3-5次。2.7将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min ；m滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；2.
