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1、细菌的革兰氏染色实验 实验目的：学习并初步掌握革兰氏染色，了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的 重要性。 实验原理：革兰氏染色法的原理是通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于 水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密， 故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝 隙。因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁 薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差。在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶 解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍
2、呈无色， 再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。实验所需试剂和仪器： 器材：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌 试剂：生理盐水，95%乙醇，碘液，结晶紫，番红，吕氏碱性美蓝，石炭酸复红，蒸馏水 仪器：载玻片，盖玻片，显微镜，吹风机，滤纸，无菌操作台实验步骤：（1）挑菌和涂布 取一洁净的载玻片，滴一小滴生理盐水于玻片中央，以无菌操作分别挑取 1 种革兰氏阴性 菌和1 种革兰氏阳性菌于液滴中涂布开来，用吹风机吹干菌液。（2）初染滴加结晶紫（以刚好覆盖菌膜为宜）初染时，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色，染色1 2min 后用水洗去结晶紫。（3）媒染用卢戈氏碘液覆盖1 min左右，水洗。（碘作为媒染剂，与
3、结晶紫结合成结晶紫一碘的复合 物，增强了染料与细菌的结合力）（4）脱色 将玻片倾斜，吸取一整管95%乙醇，用滴管流加脱色（乙醇脱色是革兰氏染色操作的关 键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌） 迅速水洗。（5）复染用番红复染，2min，水洗。革兰氏阳性菌仍保留初染剂的蓝紫色，而革兰氏阴性菌被染上 复染剂的红色。（6）干燥镜检 倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。 用电吹风吹干，或自然干燥。 涂片完全干燥后，用油镜观察。实验结果：大肠杆菌（G-）：红色 枯草芽孢杆菌（G+）：蓝紫色 实验思考与讨论：（1）是否可以不做复染？ 可以。用中性脱色剂如乙醇
4、或丙酮脱色，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被 褪色而呈无色。最后一步用番红染液复染，是为了让结果更清楚。（2）微生物经固定后是死的还是活的？ 死的，微生物经固定后结构发生改变，蛋白质已经发生变性。（3）通过革兰氏染色，你认为它在微生物学中有何实践意义?革兰氏染色首先能让菌体染色，从而能通过显微镜更好地观察细菌的形态和特点，区分球菌、 杆菌等细菌形态。更重要的是，革兰氏染色能将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，为 细菌鉴定提供了主体方向，同时，对革兰氏阴性或阳性菌的治疗用药也是不同的。（4）生物的染色原理是什么? 微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化学因素的作用而进行的。物理因
5、素如细胞及细 胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性 质而发生地各种化学反应。酸性物质对于碱性染料较易吸附，且吸附作用稳固；同样，碱性物质对酸性染料较易于吸附。 如酸性物质细胞核对于碱性染料就有化学亲和力，易于吸附。要使酸性物质染上酸性材料， 必须把它们的物理形式加以改变（如改变pH值），才利于吸附作用的发生。相反，碱性物 质（如细胞质）通常仅能染上酸性染料，若把它们变为适宜的物理形式，也同样能与碱性染 料发生吸附作用。细菌的等电点较低，pH值大约在25之间，故在中性、碱性或弱酸性 溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此，带阴电的 细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。（5）用革兰氏染色法染大肠杆菌和枯草杆菌后各得什么结果（包括颜色、细菌形态、为何种 染色反应等）？ 大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是 革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状。
