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1、血小板衍生膜微粒对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响陈宝安，仲悦娇，黄成垠，李翠萍，史光耀，肖建宇，唐荣才丁家华，高冲，孙耘玉，程坚，王骏，赵刚，马燕，宋慧慧，费菲，裴孝平【关键词】血小板膜衍生微粒材料和方法仪器血小板悬液由江苏省血液中心成份科提供，均为血细胞别离机采集的安康供血者的新颖血小板，浓度为900-1200109/L。将血小板悬液于222经2500rp离心10分钟，沉淀物悬浮于缓冲液中(Na2EDTA：9l/L,Na2HP4：26.4l/L,Nal:140l/L),并用缓冲液洗涤2次。最后将洗涤的血小板悬浮于Tyrde缓冲液中(Nal：137l/L,NaH3：12l/L,葡萄糖：5.5l/
2、L,Kl：2l/L，gl:1l/L,NaHP4：0.3l/L)。调整血小板浓度为8108/l。采用1.0U/l的凝血酶激活血小板放37恒温摇床上振荡30分钟。激活后的血小板于4，4000rp离心20分钟,上清别离于另一试管中，于4，17000rp，离心1小时，并洗涤1次，沉淀物悬浮于Tyrde缓冲液中4，5，整个操作在无菌条件下进展。血小板衍生膜微粒的定量等量1多聚甲醛固定PP后用D61标记PP，选择直径1的微粒确定PP的直径阈值，同时设定同型对照。用流式细胞仪分析高速离心前后PP的纯度。采用BA蛋白浓度定量试剂盒检测PP的浓度，步骤如下：根据样品数量，将BA试剂AB按501的比例配成BA工作
3、液，充分混匀。用缓冲液II溶解蛋白标准品，蛋白标准品的终浓度为0.5g/l。将标准品按0、1、2、4、8、16、20l分别参加96孔板中，加缓冲液II补足到20l。加20lPP到96孔板各孔中，各孔中参加200lBA工作液，37放置30分钟。用酶标仪测定570n处各孔吸光度，根据标准曲线判断PP的蛋白浓度。种蛋的消毒和孵育纯种华联司法部购自南京制药机械厂。利用光照选择钝端气室小的鸡卵产蛋时间为7天，要求外表清洁，蛋壳均质，每个50-65g，蛋形标准。种蛋用温水清洗、擦干，于40-45的新洁尔灭液11000稀释中浸泡3分钟，擦干放入蛋托，用紫外线消毒30分钟备用。将隔水式电热恒温培养箱通电预热，
4、使温度升至37.0。种蛋孵育于隔水式电热恒温培养箱，温度37.00.5，培养箱中同时放入一小烧杯水，保持湿度在40%-60%。种蛋气室向上，蛋托与胚蛋长轴约呈70-80，每天早晚各小心转动1次。PP对A新生血管的影响取孔径为0.8的混合纤维素滤膜,用打孔器制成直径5的小圆片,放蒸馏水浸泡后，灭菌备用。取孵化的9日龄胚蛋，随机分为4组，每组20只蛋。在照卵灯下寻找胚头右下方血管稀少区，划定11圆形开窗位置，在鸡胚气室端钻1小孔并穿透壳膜。用75%乙醇消毒开窗部位，用手术剪轻轻揭去蛋壳及壳膜，暴露出鸡胚绒毛尿囊膜，将混合纤维素滤膜放置于尿囊膜上血管较少的部位。实验分组：对照组生理盐水；40g/lP
5、P组；80g/lPP组；10l/lVEGF组。用微量进样器分别将上述液体20l滴入滤膜中，然后用无菌透明胶带封窗，放入孵化箱，继续孵化。3天后揭去透明胶带，参加适量甲醇、丙酮等量混合固定液，在室温下固定15分钟。然后以混合纤维素滤膜为中心，剪取3的A，放入盛有水的平皿中展开，然后平铺于滤纸上，制成A标本。结果判断在解剖显微镜下观察鸡胚绒毛尿囊膜血管的生长情况,数码相机进展原位摄影。用扫描仪扫描底片,选取画面明晰者,选用Iagetl软件处理图像统计出混合纤维素滤膜周围5范围内的血管分支点数6，并计算出所选区域血管面积与A面积的比值。统计分析利用SPSS10.0统计软件，计数资料用秩和检验。结果制
6、备的PP的纯度鉴定流式细胞仪检测结果说明，1.0U/l凝血酶作用后的PP释放率为50.1%；17000rp离心1小时后PP的纯度99图1。实验开场时,每组鸡胚数为20个,到第11天取膜时各组存活的鸡胚均在15枚以上。对照组A血管形态呈自然生长状态下的叶脉状(图2A),40g/lPP组与对照组无差异，80g/lPP组及VEGF组在混合纤维素滤膜周围可见到不同程度放射状密集生长的血管网(图2B、2),而对照组及低Figure2.Allantivesselsinthreegrupsafterinubatinfr72hurs.A:nralgrthfbldvesselsinhikhriallantiebrae;B:bldvesselnetinaspkedheelpattern;:vasprliferativerespnseparabletthatinduedbyVEGF(riginalagnifiatin:6.1)浓度PPs组均无特异性密集血管生成。各组A血管分支点数及血管面积的比拟见表1。当PP的浓度为80g/l时，A的血管生成表现形式、血管分支点数和血管面积均优于对照组,与对照组比拟差异有显著性(P0.05)。结果说明，PP80g/l对A新生血管的生成有明显促进作用。讨论PP是血小板在诱导剂作用下，细胞膜以出芽方式形成囊泡或伪足断裂而形成直径
