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1、植物组织培养：概念：在无菌和人工控制的环境下，利用适当的培养基，对离体的植物器官，组织，细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。分类：愈伤组织培养、悬浮细胞培养、器官培养、茎尖分生培养、组织培养、原生质体培养。理论依据：细胞的全能性：任何有完整细胞核的植物细胞，具有全部的遗传信息，在一定条件下均具有分化，发育成一个完整植株的潜在能力。细胞全性实现条件：1.组织或器官离体（解除植物其余部分对这些细胞质的抑制性）2.给与所需营养条件，特别是激素对器官分化起决定性作用。分化途径：外植体（离体的植物器官、组织、细胞）经过脱分化形成愈伤组织，经过再分化形成不定根、不定芽和胚状体，最后形成植
2、株，或者直接由外植体分化形成不定根、不定芽和胚状体，然后形成植株。应用前景：1.理论研究方面的应用：研究细胞分化和器官建成响应因素的主要方法2植物离体快繁3.人工种子的制备4.次生产代谢物的产生5.脱毒培养6.种质资源的保存和交换7.遗传操作实验室:1.准备室:功能：材料培养器械的清洗，培养基、灭菌的准备工作普通化学实验室：仪器：纯水仪、冰箱、移液枪、过滤灭菌器、电炉、微波炉、磁力搅拌器、低速台式离心机、电脑。作用：配制培养基洗涤室：仪器：储存器皿设备、鼓风干燥箱。作用：洗涤用具灭菌室：仪器：棉塞、无菌纸。作用：灭菌消毒2.无菌操作室：功能：进行植物材料分离接种的重要场所，需长时间的无菌操作对
3、组织培养成功起关键作用。仪器：超净工作台、紫外灯、固定式和移动载物台、消毒器、酒精灯、广口瓶、酒精棉、机械支架、手术剪、解离刀、解剖针3.培养功能：进行材料的培养场所。设备：可控光、温、湿度等设备，固定式培养架，转床，摇床，适当的培养基4.细胞学实验室：功能：细胞学和组织学观察。设备：高倍显微镜，切片机，相机，恒温箱5.温室：功能：组培苗的移栽锻炼。灭菌方法及适用范围：概念：1.灭菌：灭杀或出去物体表面和空隙内的所有微生物。2.消毒：杀死物体上的病源微生物灭菌方法:1.干热灭菌法适用玻璃器皿2.温热灭菌法适用培养基灭菌3.蒸熏灭菌法适用培养室、接种室灭菌4.过滤灭菌法适用液体培养基5.药剂灭菌
4、法适用培养材料灭菌6.灼烧灭菌法适用接种器具7.射线灭菌法适用室内灭菌培养基主要成分及作用：无机盐类：构成植物细胞中核酸、蛋白质以及生物膜系统等必不可少的营养元素有机化合物：提供碳源和能源植物生长调节物质：不仅可以促进植物组织的脱分化和形成愈伤组织，还可以诱导不定芽、不定胚的形成附加物：减少外植体的褐变。培养基种类及特点：按目的分：1.诱导培养基：外植体诱导产生愈伤组织的培养基2.继代培养基：使愈伤组织继续生长.分化培养基：诱导愈伤组织分化4.生根培养基：诱导再生苗生根的培养基按物理状态分：1.固体培养基：方便占地不大但植株只能与部分培养基接触，受营养不均匀2.液体培养基：吸收营养充分，换液较
5、复杂细胞的组织培养：对植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。单细胞分离方法:机械法:优点1.细胞不受酶的伤害2.不会发生质壁分离。缺点：1.要求薄壁细胞排列分散2.产量低酶解法：优点：分离细胞能得到较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞。缺点：分离细胞时，必须给酶溶液给予渗透压保护，防治细胞胀裂。由培养的愈伤组织中分离单细胞:振荡的作用：1.对细胞团施加一定的缓和压力。使之破碎成小细胞团或单细胞2.使细胞与细胞团在培养基中均匀分布.促进培养基气体交换，保证正常呼吸单细胞的培养方法：平板培养：是将悬浮培养的细胞接种到未固化的薄层培养基中，使其与培养基充分混
6、合，再倒入培养皿中进行培养的方法。培养过程中应注意：1.选择合适的培养基，以降低细胞起始密度2.选用分裂旺盛时期的细胞（分裂能力强，不用处于静止期过久的细胞）3.培养基的温度要严格控制135C,过低，操作困难，凝固块使细胞分布不均匀。过高，细胞受伤害看护培养法：用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织来培养细胞的一种方法。特点：不仅给单细胞提供了营养成分，而且还提供了促进细胞分裂的其他活性物质。微室培养：将细胞放到人工制造的小室中进行培养的方法。优点：在培养过程中可以连续进行显微观察，把一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。条件培养基培养：在培养基中加入高密度的细胞进行培养，一定时
7、间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使培养基条件化。细胞的悬浮培养（P109）:将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。分批培养（P109）：把细胞分散在一定容积的培养基进行培养，建立单细胞培养物的方法。变化曲线“S”形：延滞期:细胞很少分裂指数生长期：细胞分裂活跃（细胞体积小，容易结团）指数生长期：细胞增值最快，单位时间内细胞增长数目大体一致（细胞体积增加，很少结团）缓慢期：由于营养耗尽或有毒代谢物的积累，细胞增长变慢静止期：生长趋于完全静止。半连续培养（P110）：利用培养罐进行细胞大量培养的方式。在半连续培养中，当培养罐内细胞数目增殖到一定量后，倒出一半细
8、胞悬浮液于另一个培养罐内，在分别加入新鲜培养基继续进行培养。特点：能够重复获得大量均匀一致的培养细胞。连续培养（P110）:利用特种的培养容器进行大规模细胞培养的方式。封闭性连续培养：在培养过程中，排出的旧培养基由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡，从而使培养系统中营养物质的总含量总是超过细胞生长的需要。特点：在培养过程中，细胞的密度会不断增加开放型连续培养：在连续培养中，注入的新鲜培养液的容积与流出的培养液容积相等，其中细胞的密度也保持恒定，并通过调节流出和流入的速度，使培养细胞的生长速度一致保持在一个稳定状态，流出的细胞数相当于培养系统中新细胞的增加数。特点：细胞密度保持恒定。浊度
9、恒定式：用一支比浊计或分光光度计来测定培养液中细胞的浑浊度，新鲜的培养液流入量与旧培养液的流出量都受光电计自动控制。当培养液中细胞密度增加时，光透量减少，从而给培养液入口一个信号，加入一定量的新培养液，同时流出等量的旧培养液，保持体积不变。当光透过量增加时，会自动停止新鲜培养液的注入和旧培养液的流出化学恒定式：米用两种方法1.固定速度注入新鲜培养基2.控制培养液的进入速度，是细胞稀释的速度正好和细胞增殖的速度相同。生长的测定（P115）:细胞计数：为提高细胞计数的准确性，可先用铬酸或果胶酶对细胞和细胞团进行处理，以增加细胞的分散性。细胞密实体积：以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。鲜重：用
10、已知重量的干尼龙网收集细胞，用水洗去培养基，真空抽滤以除去细胞多余的水分，称量。干重：用已知重量的干尼龙网收集细胞，在60C下干燥12h,在称量。细胞干重以每毫升培养物或每io6个细胞的重量来表示细胞有丝分裂的指数：在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占细胞总数的百分数。一个迅速生长的细胞群体其有丝分裂指数为3%5%。对于愈伤组织一般是采用孚尔根染色法。植板率：表示能分裂长出细胞团的细胞占接种细胞总数的百分比。植板率=每个平板形成的细胞团数/每个平板接种的细胞总数X100细胞活力测定：TTC（四唑盐还原法）：活细胞由于呼吸作用可产生还原力，可将三苯思唑氯化物还原呈红色染料，据此可测定细胞的呼吸
11、效率。还可将还原的TTC红色染料用乙酸乙酯提取出来，用分光光度计进行测定，计算细胞的相对活力FDA（荧光素二乙酸法）：FDA即不发荧光也不具有极性，能自由地穿过细胞膜进入细胞内部，在活细胞内FDA被酯酶分解，产生荧光素，在荧光显微镜下观察到产生荧光的细胞，表明是有活力的细胞，相反则是无活力的细胞。细胞活力以发绿色荧光的活细胞的百分数表示伊凡蓝染色法：当用伊凡蓝的稀溶液对细胞进行处理时，只有死细胞和活力受损伤的细胞能够吸收这种染料，而完整的活细胞不能摄取或积累这种染料。细胞活力以未染色的活细胞数占总观察细胞数的百分数来表示。原生质体的分离和纯化：分离：机械法：缺点：量少，只能取液泡化程度大的长形
12、细胞酶分离法：1.两步法：先用果胶酶处理材料，游离出单细胞，然后再用纤维素酶处理单细胞，然后再用纤维素酶处理单细胞，分离出原生质体。优点：所获得的原生质体均匀一致、质量好，但操作繁杂，2.步法：将纤维素酶和果胶酶等配置成混合酶液来处理材料，一步获得原生质体，操作简便。纯化：沉降法：原理：利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中进行过滤离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。优点：纯化收集方便。缺点：原生质体纯度不高。漂浮法：原理：采用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后，使原生质体漂浮于液体表面而残渣碎屑沉降于底部。优点：获得的原生质体纯度高。缺点：原生质体的收率低，高渗溶液对原生质体有害。
13、界面法：原理：利用两种比重不同的溶液，使完整的原生质体处于两液相约的界面之中。优点：可收集到较大纯净的原生质体，避免收集过程中细胞破损。影响原生质体数量和活力的因素：光：黑暗，静止条件下温度：25C30C酶解时间：小于24h太长时间影响活力细胞壁降解酶的种类和组合渗透压稳定剂原生质膜稳定剂PH原生质体融合：通过物理或化学方法使原生质体融合，经培养获得具有双亲全部遗传物质的后代的方法。原理：细胞膜表面有稳定的疏水性基团，具有膜电位，因其静电斥力使原生质体不能吸附在一起。1.化学融合法：带有阴离子的的PEG分子等与原生质体表面的阴离子之间在Ca2连接下形成共同的静电键，从而促进了原生质体间的黏着和
14、结合。2.物理法融合法：对融合槽的两个平行电极施加高频交流电压，产生电泳效应，使融合槽内的原生体偶极化并沿着电场的方向排列成串珠状，再施加瞬间的高压直流脉冲，使黏合相邻的原生质体膜局部发生可逆性瞬间穿孔，然后，原生质体膜连接、闭合，最终融为一体。方法：1.物理方法：离心、振动、电刺激2.电融合：微电极控制仪。杂种细胞的选择：互补筛选法：1.激素自养型互补选择2.白化互补选择3.营养缺陷型互补选择4.抗性突变互补选择5.基因互补选择机械筛选法：1.一种方法是设计一个选择程序，使在某种条件下只有杂种细胞生长，而任何一个亲本不能在此条件下生长，生长缓慢或中途夭折，存活下来的为杂种细胞2.借助于显微镜
15、技术将融合体或杂种细胞直接挑选出来继续单独培养，目前较有发展前途的是荧光协调技术与显微镜结合的方法。杂种植株的鉴定：1.形态学鉴定2.杂种和亲本的核型分析3.生物化学鉴定4.分子生物学鉴定遗传的特点：.体细胞无性系的遗传稳定性（离体培养的细胞学基础是有丝分裂）2即使发生变异，也可以及时淘汰变异。变异的特点：.普遍性：可发生在各种培养类型中，发生在各种植株的培养中，变异发生与培养类型有关。2局限性：从表型上看，植株形态，生长势，盲性，某些抗性等性状的变异。从生理生化上看，易出现同工酶谱，次生代谢的消长等变异、3嵌合性：指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，是组培中的常见现象，器官、离体培养
16、时易发生嵌合。影响遗传变异的因素：1.供体植株：供体植株倍性水平：多倍体和染色体数目多的植株其变异频率比二倍体和单被体高，多倍体染色组以缓冲染色体数目变异引起的不平衡，突变体易成活基因型外植体分化程度：分化程度高的分生细胞变异少。2培养基及培养方式：不同的激素浓度可以有选择地诱导不同倍性的细胞分裂，激素除了引起染色体倍性的增加外，在一些培养中及发现染色体倍性减少的现象3继代次数：一般来讲，继代时间越长，继代次数越多细胞变异的几率就越高。体细胞无性系变异的诱导、筛选与应用：诱导：1.离体培养细胞的自发突变：组培后变异的原因：a分化程度不同，嵌合性。B植株的再生式，生长调节物质，继代培养的时间c由外遗传变异及生理作用引起的变异外植体为体细胞的称体细胞变异，为性细胞的为性细胞变异体细胞无性系自发变异的特征表现在：随机性，无法精确分批重复2人工诱发突变：物理方法：X射线、Y
