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1、 本科生毕业论文(设计)题目：梨花粉水孔蛋白初探所在院系：专 业：姓 名：学 号：指导教师： 生物科学与化学学院 生物科学 范洪刚 0810910005 徐 国 华论文完成日期： 2012年 5 月 目 录摘要3关键词3英文摘要.3英文关键词3一、实验材料与试剂配制方法3（一）实验材料3（二）主要试剂及配制方法4-5二、实验步骤及方法5三、实验中遇到的问题及解决办法5（一）PEG4000药品用量问题5（二）每一份花粉培养皿中培养液体积的问题5（三）关于花粉发后离心所需要的转速问题5（四）关于荧光显微镜的使用方法5（五）关于染色剂选择的问题5-6（六）关于培养温度和渗透压问题 6 (七) 关于花
2、粉涂抹的问题6（八）关于封片的一些问题6（九）关于花粉的选择问题 6四、实验结果分析与讨论6五、参考文献6-7致谢7梨花粉水孔蛋白初探范洪刚 pb0810910005江苏教育学院生物系摘要：梨花粉在不同渗透压下萌发率和花粉管长度会发生变化，在半抑制条件的渗透压下，水孔蛋白的抑制剂和激活剂处理花粉培养基，会影响花粉萌发率及花粉管长度。在半抑制条件下，在培养基中加入适当浓度的抑制剂会降低萌发率，花粉管长度变短，适当浓度的激活剂会提高花粉萌发率及增加花粉管长度，说明水孔蛋白的活性在一定程度上影响花粉的萌发率和花粉管长度的伸长。本文通过荧光显微镜观察花粉萌发实验，发现其中一些问题，并举出一些解决办法。
3、关键词：水孔蛋白； 梨；花粉萌发率；花粉管长度；荧光标记Abstract: the pear flower powder in different osmotic pressure and pollen tube length under germination ratio can produce change, in half of the conditions of the inhibition osmotic pressure, the hole of the inhibitors and activate protein processing agent pollen culture
4、medium, can affect pollen germination rate and pollen tube length. In the half inhibit conditions, with appropriate in culture of the concentration of the inhibitors reduce germination rate, pollen tube length are short and the appropriate concentration activation agent can improve the pollen germin
5、ation rate and increase the pollen tube length, the protein that hole activity in the impact on pollen germination rate and elongation of pollen tube length. This article through the fluorescence microscopeObserve pollen germination experiment, find some of these issues, and given a some solutions.K
6、eywords: water holes protein; Pear; Pollen germination rate; Pollen tube length; Fluorescent marker很早以前,人们认为水分是以自由扩散的方式进出细胞的,后来注意到动植物的一些器官、组织具有独特的水分运转能力，例如: 动物的红细胞和肾上皮细胞,它们运输水分的速度远非只凭扩散运输所能解释的,人的肾脏细胞平均每昼夜要过滤180L的水，植物在种子萌发及花粉管伸长时要伴随着由体积增大而发生的水分快速吸收,这些现象均使人们猜测是否有介导水分运输的孔道存在。20世纪90年代初,Wayne 等指出在植物的质膜上存
7、在着水分运输通道。1992年Preston等第一次分离出具有水分运输特性的蛋白CHIP28( channel-formingprotein of 28 ku) ,它是红细胞质膜内在蛋白,在质膜上形成水分选择性运输通道,1997年被基因组命名委员会重命名为AQP1。AQP1 的发现,掀起了人们分离、鉴定水孔蛋白( 亦称水通道蛋白) 的高潮。短短几年内,人们已在细菌、酵母、动物、植物中分离出许多水孔蛋白同源基因。在植物中第一个水孔蛋白TIP是由Maure 等于1993 年从拟南芥中分离出来的。TIP的cRNA 在爪蟾卵母细胞( Xenopus oocytes) 中的异源表达,证明它具有水分运输特性
8、,属于植物水孔蛋白中的液胞膜内在蛋白(Tonoplas-t membrane intrinsic protein,TIP)。植物质膜内在蛋白( Plasma membrane intrinsic protein, PIP)也是在拟南芥中首次发现的，Kammerloher 等( 1994)用拟南芥根质膜内在总蛋白产生的多克隆抗血清来免疫筛选( immunoscreening) 拟南芥根cDNA文库, 得到了几个阳性克隆, 经鉴定为植物质膜水孔蛋白。水孔蛋白与1984 年Gorin 等从牛晶体纤维( bovine lens fiber)细胞膜中分离到的MIP 基因(Major intrinsic
9、protein)具有很高的序列同源性和结构相似性, 因此将它们同归于MIP 家族,分子质量在26 29 ku 之间, 在生物膜中形成水通道并携助水分跨膜运输的膜内在蛋白。绝大多数水孔蛋白形成水的选择性通道, 但也有一些水孔蛋白同时也可运输小分子中性亲水溶质。一、实验材料与试剂配制方法（一）实验材料本实验用梨品种丰水和翠冠花粉为试材，采自江苏省农业科学研究院梨园。成熟的花药采下包裹于称量纸中置密闭的硅胶瓶中常温干燥1 d 后置- 20 冰箱中保存备用。（二）主要试剂及配制方法1.花粉培养花粉培养基：（母液一：浓缩十倍）MES(g)蔗糖（g）硼酸（g）硝酸钙（g）水（ml）2.9350.000.0
10、50.1550.00激活剂-巯基乙醇:(取六支试管分别标记100%、10%、1%、0.1%、0.01%、o.oo1%对应加入母液-巯基乙醇逐级稀释加入)抑制剂氯化汞：（配置10mmol/L、1mmol/L、0.1mmol/L、0.01mmol/L、0.001mmol/L）PEG4000+PEG6000配置11份。（母液二）PEG4000(g)PEG6000(g)水（ml）5.000.187518花粉培养编号培养皿1111234567891011母液一2.5ml+母液二+-巯基乙醇100%2.5ml加水定容至25ml母液一2.5ml+母液二+-巯基乙醇10%2.5ml加水定容至25ml母液一2.
11、5ml+母液二+-巯基乙醇1%2.5ml加水定容至25ml母液一2.5ml+母液二+-巯基乙醇0.1%2.5ml加水定容至25ml母液一2.5ml+母液二+-巯基乙醇0.01%2.5ml加水定容至25ml母液一2.5ml+母液二+-巯基乙醇0.001%2.5ml加水定容至25ml母液一2.5ml+母液二+氯化汞10mmol/L2.5ml加水定容至25ml母液一2.5ml+母液二+氯化汞1mmol/L2.5ml加水定容至25ml母液一2.5ml+母液二+氯化汞0.1mmol/L2.5ml加水定容至25ml母液一2.5ml+氯化汞0.01mmol/l2.5ml加水定容至25ml母液一2.5ml+氯
12、化汞0.001mmol/L2.5ml加水定容至25ml2.荧光显微观察主要试剂配制方法50%甘油分析纯 40ml:量筒分别量取20ml PIPES和甘油，将两种液体在试剂瓶中混匀既得所需溶液。4冰箱保存待用。4%多聚甲醛（用50mMPipes试剂配制）分析纯 50ml:计算得配制50ml的4%多聚甲醛溶液所需多聚甲醛质量为2g，分析天平称取2g多聚甲醛加入45ml蒸馏水在水浴锅中将其溶解，将溶液转移入50ml容量瓶中加蒸馏水定容至50ml混匀既得所需溶液。4冰箱保存待用。磷酸缓冲液（PBS） PH 7.4 200ml:磷酸缓冲液由磷酸二氢钾和氢氧化钠配制，分析天平称取1.36g 磷酸二氢钾加入
13、79ml0.1mol/l氢氧化钠中溶解，将溶液转移入200ml容量瓶中加蒸馏水定容至200 ml混匀既得所需溶液。4冰箱保存待用。染色液的配制：染色液用的缓冲液配制，其中加入终浓度质量比的二甲基亚砜，终浓度的乙二醇二乙醚二胺四乙酸，终浓度质量体积比的蔗糖，再加入终浓度的异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽；二、实验步骤及方法取出在-20下保存的丰水花粉，放在室温下2小时，取出培养皿，在编号一至十一的培养皿中均匀的涂抹花粉，放入20培养箱中进行培养，设置一组对照组12（没有添加激活剂或者抑制剂，且在正常渗透压下）。1. 在花粉培养一小时后，用移液器分别取出1ml培养基液体，放入标记好的1.5ml离心管，
14、编号1h1、1h2、1h12。2用离心机进行离心，转速设置为8000，时间4min，用移液器小心吸尽培养液。3.固定：将花粉在4%多聚甲醛固定液中室温固定一小时。4.分别重复步骤13将2h-7h的花粉固定。5.洗涤：用50mMpipes缓冲液洗两次，每次十分钟6.用PBS缓冲液冲洗一次，10min7.染色：将花粉在染色液中黑暗处理0.51h8.封片及封边：以50%甘油封片，透明指甲油封边，荧光显微镜(Zeiss，Axiovert 40 cel)观察，采集图片。三、实验中遇到的问题及解决办法1.PEG4000药品用量问题由于花粉培养基中配置所需要的peg4000的量比较大，如果直接加入，所购买的药品量不够，因此，通过和指导老师交流找到了解决办法，在刚开始配置花粉培养母液时不加入peg4000，等到最后一步配制花粉培养最终培养基时加入，每一份仅需5g，这样大量减少了其使用的量，既避免了浪费，又可以使实验继续进行下去。2.每一份花粉培养皿中培养液体积的问题 第一次做的时候，取花粉培养液进行离心时，取到第四个小时之后，培养皿中培养液基本减少完毕，不能够继续做剩下的第5、6、7小时的花粉离心固定，因此通过计算，通过增加花粉培养液体积，最终每次培养用25ml培
