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1、实时荧光定量PCR技术及其在核酸定量检测中的应用任广睦，王英元(山西医科大学法医学院，山西 太原 030001)【摘要】实时荧光定量PCR技术近年来被广泛应用于基础医学及分子生物学研究中， 它以其操作简便、高通量检测、特异性强、灵敏度高、定量准确、全封闭反应等优点成为了 分子生物学研究中的重要工具，本文就该技术的原理、方法、研究进展及其在核酸定量检测 中的应用进行了综述，旨在为法医学实践提供新的研究思路和核酸定量检测方法。【关键词】法医物证学；实时荧光定量PCR；核酸定量Real-Time Quantitative PCR Technique and Application of nuclei
2、c acid Quantitative detection/(REN Guang-mu， WANG Ying-yuan./School of forensic medicine Shanxi Medical University， Shanxi Taiyuan 030001， China)【 Abstract】 The fluorescence-based real-time PCR technique is widely used for basic research， molecular medicine and biotechnology. It is a critical tool f
3、or assays are easy to perform， capable of high throughput， and can combine high sensitivity with reliable specificity. In this review， principle， methods and research advancement of real-time PCR technique and application of nucleic acid quantitative detection are discussed， which may provide a new
4、research idea and nucleic acid quantitative detection method for forensic medicine practice.【 Key words】 Forensic physical evidence； Fluorescence-based real-time quantitative PCR； nucleic acid quantitation聚合酶链式反应技术(PCR)自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和 快速性在医学和分子生物学等领域得到广泛的应用。近年来出现的核酸定量 PCR 技术尤其是实时荧光定量PCR(real-t
5、ime quantitative PCR，RQ-PCR)技术实 现了 PCR 从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量 准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，本文就 此技术的研究进展及其在核酸定量检测中的应用做一综述。1 实时荧光定量 PCR 技术的原理及方法实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的 方法2-5。它在常规 PCR 基础上添加了荧光染料或荧光探针。荧光染料能特异性掺入 DNA 双链，发出荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信
6、号，从而 保证荧光信号的增加与 PCR 产物增加完全同步。荧光探针法是将荧光共振能量 传递（fluorescence resonance energy transfer , FRET）技术应用于常规 PCR 中， 在探针的5端标记一个荧光报告基团（R）, 3端标记一个淬灭基团（Q）,两 者可构成能量传递结构，即5端荧光基团所发出的荧光可被淬灭基团吸收或抑 制；当两者距离较远时，抑制作用消失，报告基团荧光信号增强，荧光监测系统 可接收到荧光信号。利用以上荧光产生原理，在 PCR 过程中可以连续不断地检 测反应体系中荧光信号的变化。当信号增强到某一阈值（PCR反应的前15个循 环的荧光信号作为荧光
7、本底信号，阈值的缺省设置为315个循环的荧光信号的 标准偏差的 10 倍）时， Ct 值被记录下来。 C 代表 Cycle， t 代表 threshold， Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。每个 模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷 贝数的对数，纵坐标代表Ct值。这样，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准 曲线上计算出该样品的起始拷贝数。在这一技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：（1）在 90 年 代早期，Taq DNA多聚酶的5
8、 核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光标 记探针6，因此使得间接的检测 PCR 产物成为可能。（2）此后荧光双标记探针 的运用使得在一个密闭的反应管中实时地监测反应全过程成为可能。这两个发现 的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致实时荧光定量PCR技术在研究 工作中的广泛运用。1996年，美国应用生物系统公司（Applied Biosystems， ABI）的ABI Prism 7700和5700、罗氏公司（Roche）的Light Cycler TM等仪器率先投入商业使用。 它们的扩增和检测全部自动化、耗时短、工作效率高。国内使用较多的有 ABI Prism7000、 7900、 7
9、700 型和 Light Cycler TM 等。 ABI Prism 7900 等 RQ-PCR 仪 可用于高通量（384孔板）检测，而ABI Prism 7000则利用了多色多通道技术。2 实时荧光定量 PCR 技术的研究进展目前最常用的实时荧光定量PCR产物的检测技术都是应用荧光染料或基团， 并将PCR与实时信号检测相结合,其中最简单的是双链DNA嵌合荧光染料技术， 本法成本低廉，但SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA 模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针法8,9。要想用荧光染料法得到比 较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量
10、要求就比较高。 而TaqMan探针法则是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的 5外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合, 所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量 10,11。随着研究的深入及试剂的商品 化，又发展出一些更完善的检测技术。2.1 TaqMan MGB水解探针技术在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。 探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。TaqMan探针根据其 3 端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种:普通的TaqMan探针和TaqMan MGB 探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(N
11、on-Fluorescent Quencher)， 本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有 MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10 C左右。因此 为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降 低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组 成不理想的情况下，短的探针比长的探针更容易设计。研究表明， TaqMan MGB 探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想12。2.2 分子灯标(Molecular beacon)分子灯标由Tyagi和Krammertml建立13。
12、该探针为单链DNA，呈茎环结 构，环部与靶DNA序列互补，为1535bp；茎部核苷酸互补，但与靶DNA无 序列同源性，约8bp。分别在探针的5端和3端标记报告荧光基团和淬灭荧 光基团。游离时，分子灯标由于一端报告荧光基团和另一端淬灭基团紧密相邻， 发出的荧光被淬灭；在PCR变性后复性阶段，探针的环部核苷酸序列与互补的 靶序列结合，形成更稳定的杂交，破坏了茎环结构产生的FRET，淬灭作用被解 除:在 PCR 延伸阶段，分子灯标又从模板上解离，重新形成茎环结构，荧光消 失14,15。随着每次扩增产物的积累， 荧光强度增加，可反映出每次扩增末扩增 产物积累的量。该法探针可循环利用，但标记较复杂，要求
13、游离在溶液中时无选 择性折叠，以免造成部分淬灭和荧光本底；同样，如果茎结构的热力学温度过高， 则会影响探针与靶序列杂交。分子灯标尤其适合于鉴定点突变。它们能区别仅单 个核苷酸差异的DNA,并且特异性要比常规等长的寡聚核苷酸探针更明显均16】。 主要用于突变检测、病原体定量、病毒复制和胎儿的性别检测。发卡式引物(sunrise primer)是对分子灯标的发展17,18，在延伸时整合进它 们的特异扩增子,产生荧光信号。其特异性仅依赖于引物序列。此法能将所有扩 增产物均标记上荧光分子，因此荧光信号响应快。但无法区分特异和非特异扩增 是其最大不足。蝎状引物(scorpion primer)是对发卡式
14、引物的进一步改进口9】。该技术在引 物与分子灯标探针之间连接一个间隔臂，使 PCR 延伸反应时不能够延伸至分子 灯标。这样，非特异扩增产物便无荧光信号；当有特异扩增产物时， 即可与分 子灯标进行杂交，产生荧光信号。既解决了非特异问题，又保留了响应快的特点。 但仍存在杂交时探针不能完全与模板匹配，且探针合成复杂等问题。已有研究证 明在热循环仪上，尤其是在快速循环条件下蝎状引物要好于TaqMan探针或分子 灯标 20。Kuhn等2U利用基于肽核酸的分子灯标(PNA-based MB)，使目标双链DNA 不须变性便能与灯标结合，克服了常规分子灯标只有在目标核酸变性条件下才能 与灯标结合的不足。2.3
15、 双杂交探针22,23此系统中用了四种寡聚核苷酸、两种引物和两种探针。两个探针各有一个标 记，以头尾相接的方式与靶扩增子退火。一个探针的3端供体分子被循环仪 的光源激发后，产生从供体到毗邻探针(相差15核苷酸)5端受体基团的 FRET。由于只有当两个探针都与模板结合时才产生荧光，因而特异性高，但影 响扩增效率。另外，需合成两个探针，也提高了成本。3 实时荧光定量 PCR 技术在核酸定量检测中的应用3.1 病毒感染的定量监测实时荧光定量 PCR 技术的出现使研究病毒的负荷和疾病进展的关系成为可 能，它不仅能对病毒定性，而且由于其实验的批间和批内差异小，重复性好，因 此能方便、快速、灵敏、准确地定
16、量病毒 DNA 或 RNA 的序列，更重要的是从 中可以动态地研究在整个病程中潜在病毒的复活或持续，从而使临床医生和病毒 学家能检测临床的变化，如抗病毒治疗的效果，耐药变异的出现等。目前运用较 多的是对乙肝病毒(HBV-DNA)、HIV-DNA的定量监测少型。3.2细胞因子mRNA的表达分析细胞因子是调节蛋白，它通过调节免疫反应在免疫系统中起着核心作用。许 多不同类型的细胞都能分泌这种低分子量的蛋白质，其中包括淋巴细胞、抗原递 呈细胞、单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞。为了阐明在许多炎症反应、自身免 疫性疾病和器官移植排异中的免疫致病途径，细胞因子 mRNA 表达谱的可靠定 量是很重要的。尽管被检样本中细胞因子含量往往极低，然而实时荧光定量 RT-PCR以其高敏感性和准确性在细胞因子的定量中越来越受到青睐陆绚。3.3 基因突变及多态性研究扩增 DNA 的核苷酸序列不需要分子克隆、宿主细胞
