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1、1 蛋白质含量测定法2 WESTERN PROTOCOL3 Western 免疫印迹(Western Blot)4 蛋白质沉淀法5 蛋白质提取的方法总汇1 蛋白质含量测定法 本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。 蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种 古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法(Biuret法)、Folin 酚试剂法(Lowry法)和紫外 吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。 其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏102
2、0 倍,比Biuret法灵敏100 倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准 蛋白质。值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白 质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都 有其优缺点。在选择方法时应考虑:实验对测定所要求的灵敏度和精确度;蛋白质的性 质;溶液中存在的干扰物质;测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变
3、成硫酸氨。经 强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品 之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下:CH2COOH| + 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)NH22NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3) 反应(1)、 (2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶 液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量,如欲求得
4、样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以 625 即得。 五种蛋白质测定方法比较如下:方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法(Kjedahl法)灵敏度低,适用于0.2 1.0mg氮,误差为2%费时810小时 将蛋白氮 转化为氨,用酸吸收后滴定 非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离)用于标准蛋白质 含量的准确测定;干扰少;费时太长 双缩脲法(Biuret法)灵敏度低120mg中速2030分钟 多肽键+碱性Cu2+紫色络合物 硫酸铵;Tris 缓冲液;某些氨基酸 用于快速测定,但不太灵敏;不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较
5、 为灵敏50100mg快速510分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶;各种核苷酸用于层析柱流出液的检测;核酸的吸收可以校正Folin 酚 试剂法(Lowry法)灵敏度高5mg慢速4060分钟 双缩脲反应;磷钼酸一磷钨酸试剂 被Tyr和Phe还原 硫酸铵;Tris缓冲液;甘氨酸;各种硫醇 耗费时间长;操作要严格计时; 颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高l5mg快速515分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质 结合时,其lmax由465nm变为595nm强碱性缓冲液;TritonX-100;SDS最好的方法;干扰 物质少;颜色稳定;颜色深浅随
6、不同蛋白质变化二、双缩脲法(Biuret法)(一)实验原理双缩脲(NH3CONHCONH3)是两 个分子脲经180C左右加热,放出一个分子氨后得到的 产物。在强碱性溶液中,双缩脲与 CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个 酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲 反应。紫色络合物紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用 来测定蛋白质含量。测定范围为 110mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、 Tris 缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速 ,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物
7、质少。主要的缺点 是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。(二)试剂与器材1. 试剂:(1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要,标准蛋 白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制 成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0. 05N NaOH配制。(2 )双缩脲试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4 5H2O )和6.0克酒石酸钾钠 (KNaC4H4O64H2O
8、),用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水 稀释到 1 升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中 有黑色沉淀出现,则需要重新配制。2. 器材: 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。(三)操作方法1. 标准曲线的测定:取12支试管分两组,分别加入0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0毫升的标准 蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后,在室温(2025 C) 下放置30分钟,于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照 液。取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横
9、座标,光吸收值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定:取23个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度。注意样 品浓度不要超过 10mg/ml。三、Folin一酚试剂法(Lowry法)(一)实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙 的配制较为困难(现在已可以订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理 与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即Folin酚试剂,以增加显色量,从而 提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是: 在碱性条件下,蛋白 质中的肽键与铜结合生成复合物。,Folin酚试剂中的磷钼酸盐一磷
10、钨酸盐被蛋白质中的酪 氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下,兰色深 度与蛋白的量成正比。Folin一酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得 到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时间较长, 要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。对 双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰 Lowry 反应。而且对后者的影响还要大得多。 酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿 素(0.5%),硫酸纳(1%),硝酸纳(1%),
11、三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%), 丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线。含硫酸铵的 溶液,只须加浓碳酸钠氢氧化钠溶液,即可显色测定。若样品酸度较高,显色后会色浅, 则必须提高碳酸钠氢氧化钠溶液的浓度 12 倍。进行测定时,加F olin酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定,但上 述还原反应只在pH=10的情况下发生,故当Folin一酚试剂加到碱性的铜一蛋白质溶液中时, 必须立即混匀,以便在磷钼酸磷钨酸试剂 被破坏之前,还原反应即能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20
12、250mg。(二)试剂与器材1. 试剂(1)试剂甲:(A) 10克Na2CO3, 2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠 (KNaC4H4O64H2O)。溶解于500 毫升蒸馏水中。(B)0.5克硫酸铜(CuSO45H2O)溶解于100毫升蒸馏水中,每次使用前,将50份(A) 与1份(B)混合,即为试剂甲。( 2)试剂乙:在2升磨口回流瓶中,加入100克钨酸钠(Na2WO42H2O) ,25克钼酸钠(Na2MoO42H2O) 及700毫升蒸馏水,再加 50毫升85%磷酸, 100毫升浓盐酸,充分混合,接上回流管,以 小火回流10小时,回流结束时,加入150克 硫 酸锂(Li2SO4), 50毫升蒸
13、馏水及数滴液 体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色,须再 重复滴加液体溴的步骤)。稀释至1升,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准 NaOH滴定,酚酞作指示剂,然后适当稀释,约加水1倍,使最终的酸浓度为1N左右。( 3)标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或g球蛋白,溶于蒸馏水,浓度为250 mg/ml左右。牛血清清 蛋白溶于水若混浊,可改用0.9 % NaCl溶液。2. 器材(1)可见光分光光度计(2)旋涡混合器(3)秒表(4)试管 16 支(三)操作方法1. 标准曲线的测定:取16支大试管, 1支作空白, 3支留作未知样品,其余试管分成两组
14、, 分别加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升标准蛋白质溶液(浓度为250mg/ml)。用水 补足到1.0毫升,然后每支试管加入5毫升试剂甲,在旋涡混合器上迅速混合,于室温(20 25C)放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙(Folin酚试剂),同样立即混匀。这一步 混合速度要快,否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置 30分钟,以未加蛋白质溶液的 第一支试管作为空白对照,于 700nm 处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座 标,吸光度值为纵座标,绘制出标准曲线。注意:因Lowry反应的显色随时间不断加深,因此各项操作必须精确控制时间,即第1支 试管加入5毫升
15、试剂甲后,开始计时, 1 分钟后,第2支试管加入5毫升试剂甲, 2分钟后 加第3支试管,余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟,则第1支试管可立即 加入0.5毫升试剂乙, 1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙, 2分钟后加第3支试管,余 此类推。待最后一支试管加完试剂后,再放置 30分钟,然后开始测定光吸收。每分钟测一 个样品。 进行多试管操作时,为了防止出错,每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。 表中是每个试管要加入的量(毫升),并按由左至右,由上至下的顺序,逐管加入。最下面 两排是计算出的每管中蛋白质的量(微克)和测得的吸光度值。Folin酚试剂法实验表格:管号 1
16、2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 (250mg/ml) 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6(约 250mg/ml) 蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4 试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白质的量(mg)吸光度值( A700)2. 样品的测定:取1毫升样品溶液(其中约含蛋白质20250微克),按上述方法进行操作, 取 1 毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测