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1、基因诊断断与基因因治疗基因诊断断与基因因治疗能能够在比比较短的的时间从从理论设设想变为为现实，主主要是由由于分子子生物学学的理论论及技术术方法，特特别是重重组DNNA技术术的迅速速发展，使使人们可可以在实实验室构构建各种种载体、克隆及及分析目目标基因因。所以以对疾病病能够深深入至分分子水平平的研究究，并已已取得了了重大的的进展。因此在在20世世纪700年代末末诞生了了基因诊诊断(ggenee diiagnnosiis)；随后于于19990年美美国实施施了第一一个基因因治疗(genne ttherrapyy)的临临床试验验方案。可见，基基因诊断断和基因因治疗是是现代分分子生物物学的理理论和技技术
2、与医医学相结结合的范范例。 基因诊断断 o 基因诊断断的含义义 传统对疾疾病的诊诊断主要要是以疾疾病的表表型改变变为依据据，如患患者的症症状、血血尿各项项指标的的变化，或或物理检检查的异异常结果果，然而而表型的的改变在在许多情情况下不不是特异异的，而而且是在在疾病发发生的一一定时间间后才出出现，因因此常不不能及时时作出明明确的诊诊断。现现知各种种表型的的改变是是由基因因异常造造成的，也也就是说说基因的的改变是是引起疾疾病的根根本原因因。基因因诊断是是指采用用分子生生物学的的技术方方法来分分析受检检者的某某一特定定基因的的结构（DDNA水水平）或或功能（RRNA水水平）是是否异常常，以此此来对相
3、相应的疾疾病进行行诊断。基因诊诊断有时时也称为为分子诊诊断或DDNA诊诊断(DDNA diaagnoosiss)。基基因诊断断是病因因的诊断断，既特特异又灵灵敏，可可以揭示示尚未出出现症状状时与疾疾病相关关的基因因状态，从从而可以以对表型型正常的的携带者者及某种种疾病的的易感者者作出诊诊断和预预测，特特别对确确定有遗遗传疾病病家族史史的个体体或产前前的胎儿儿是否携携带致病病基因的的检测具具有指导导意义。o 基因诊断断的原理理及方法法 （一）基基因诊断断的原理理疾病的发发生不仅仅与基因因结构的的变异有有关，而而且与其其表达功功能异常常有关。基因诊诊断的基基本原理理就是检检测相关关基因的的结构及及
4、其表达达功能特特别是RRNA产产物是否否正常。由于DDNA的的突变、缺失、插入、倒位和和基因融融合等均均可造成成相关基基因结构构变异，因因此，可可以直接接检测上上述的变变化或利利用连锁锁方法进进行分析析，这就就是DNNA诊断断。对表达产产物mRRNA质质和量变变化的分分析为RRNA诊诊断(RRNA diaagnoosiss)。（二）基基因诊断断的方法法基因诊断断是以核核酸分子子杂交(nuccleiic aacidd moolecculaar hhybrridiizattionn)和聚聚合酶链链反应（PPCR）为为核心发发展起来来的多种种方法，同同时配合合DNAA序列分分析，近近年新兴兴的基因因
5、芯片可可能会发发展成为为一种很很有用的的基因诊诊断方法法。 DNA诊诊断 常用检测测致病基基因结构构异常的的方法有有下列几几种。斑点杂杂交：根根据待测测DNAA 样本本与标记记的DNNA探针针杂交的的图谱，可可以判断断目标基基因或相相关的DDNA片片段是否否存在，根根据杂交交点的强强度可以以了解待待测基因因的数量量。等位基基因特异异的寡核核苷酸探探针（aalleele-speeciffic oliigonnuclleottidee prrobee, AASO proobe）杂杂交：是是一种检检测基因因点突变变的方法法，根据据点突变变位点上上下游核核苷酸序序列，人人工合成成约199个核苷苷酸长度
6、度的片段段，突变变的碱基基位于当当中，经经放射性性核素或或地高辛辛标记后后可作为为探针，在在严格杂杂交条件件下，只只有该点点突变的的DNAA样本，才才出现杂杂交点，即即使只有有一个碱碱基不配配对，也也不可能能形成杂杂交点。一般尚尚合成正正常基因因同一序序列，同同一大小小的寡核核苷酸片片段作为为正常探探针。如如果受检检的DNNA样本本只能与与突变AASO探探针，不不与正常常ASOO探针杂杂交，说说明受检检二条染染色体上上的基因因都发生生这种突突变，为为突变纯纯合子；如果既既能与突突变ASSO探针针又能与与正常AASO探探针杂交交，说明明一条染染色体上上的基因因发生突突变，另另一条染染色体上上为正
7、常常基因，为为这种突突变基因因的杂合合子；如如果只能能与正常常ASOO探针杂杂交，不不能与突突变ASSO杂交交，说明明受检者者不存在在该种突突变基因因，如图图21-1所示示。若与PCCR方法法联合应应用，即即PCRR/ASSO探针针杂交法法(PCCR/AASO proobe hybbriddizaatioon)，是是一种检检测基因因点突变变的简便便方法，先先用PCCR方法法扩增突突变点上上下游的的序列，扩扩增产物物再与AASO探探针杂交交，可明明确诊断断突变的的纯合子子和杂合合子。此此法对一一些已知知突变类类型的遗遗传病，如如地中海海贫血、苯丙酮酮尿症等等纯合子子和杂合合子的诊诊断很方方便。也
8、也可分析析癌基因因如H-rass和抑癌癌基因如如p533的点突突变。单链构构象多态态性（ssinggle strrandd coonfoormaatioon ppolyymorrphiism, SSSCP）分分析相同同长度的的单链DDNA因因其序列列不同，甚甚至单个个碱基不不同，所所形成的的构象不不尽相同同，在非非变性聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶电泳时时速度就就不同，若若单链DDNA用用放射性性核素标标记，显显影后即即可区分分电泳条条带。一一般先设设计引物物对突变变点所在在外显子子进行扩扩增，PPCR产产物经变变性成单单链后进进行电泳泳分析。PCRR/SSSCP方方法，能能快速、灵敏、有效地地检测DD
9、NA突突变点，如如图211-2，此此法可用用检测点点突变的的遗传疾疾病，如如苯丙酮酮尿症、血友病病等，以以及点突突变的癌癌基因和和抑癌基基因。限制制性内切切酶图谱谱（reestrricttionn maap）分分析，如如果DNNA突变变后改变变了某一一核酸限限制性内内切酶的的识别位位点，使使原来某某一识别别位点消消失，或或形成了了新的识识别位点点，那么么相应限限制性内内切酶片片段的长长度和数数目会发发生改变变。一般般基因组组DNAA经该种种限制性性内切酶酶水解，再再做Soouthhernn印迹，根根据杂交交片段的的图谱，可可诊断该该点突变变，如图图21-3所示示。如果果用PCCR扩增增该突变变
10、点的外外显子，PPCR产产物经该该种酶消消化后，进进行琼脂脂糖电泳泳，溴乙乙锭染色色后可直直接观察察片段的的大小及及数目。此法可可用于检检测有些些限制性性内切酶酶识别位位点消失失的遗传传疾病，如如镰状细细胞贫血血。或基基因缺失失的疾病病如地地中海贫贫血症，单单纯性生生长激素素缺乏症症等。限制性性片段长长度多态态性（rresttricctioon ffraggmennt llenggth pollymoorphhismm ,RRFLPP）遗传传连锁分分析人群群中个体体间DNNA的序序列存在在差异，据据估计每每1000-2000个核核苷酸中中便有11个发生生突变，这这种现象象称为DDNA多多态性。
11、有些DDNA多多态性可可改变某某一限制制性内切切酶的识识别位点点，因而而产生了了DNAA限制性性片段长长度多态态性。RRFLPP按孟德德尔方式式遗传，在在某一特特定的家家庭中，如如果某一一致病基基因与特特定的多多态性片片段连锁锁，可以以遗传给给子代，因因此这一一多态性性片段可可作为遗遗传标记记，来判判断该家家庭成员员或胎儿儿的基因因组中是是否携带带该致病病基因，见见图211-4，此此法可用用于诊断断甲型血血友病、苯丙酮酮尿症、享延顿顿舞蹈病病等。 DNNA序列列分析对对致病有有关的DDNA片片段进行行序列测测定，是是诊断基基因异常常（已知知和未知知）最直直接和准准确的方方法。 RNA诊诊断 R
12、NA诊诊断主要要是分析析基因的的表达功功能，检检测转录录物的质质和量，以以判断基基因转录录效率的的高低，以以及转录录物的大大小。RNAA印迹（NNorttherrn bblott）RNNA印迹迹是检测测基因是是否表达达，表达达产物mmRNAA的大小小的可靠靠方法，根根据杂交交条带的的强度，可可以判断断基因表表达的效效率。RT-PCRR是一种种检测基基因表达达产物mmRNAA灵敏的的方法，若若与荧光光定量PPCR结结合可对对RT-PCRR产物量量进行准准确测定定。o 基因诊断断的应用用 （一）遗遗传疾病病现知遗传传疾病有有数千种种，但多多数遗传传疾病属属少见病病例，有有些遗传传疾病在在不同民民族
13、，不不同地区区的人群群中发病病率不同同，例如如镰状细细胞贫血血（siicklle ccelll annemiia）,非洲黑黑色人种种发病率率高，而而囊性纤纤维化症症（cyystiic ffibrrosiis）常常见于美美国白色色人种，这这二种遗遗传疾病病在我国国为罕见见病例。中国较较常见的的遗传疾疾病有地地中海贫贫血、甲甲型血友友病、乙乙型血友友病、苯苯丙酮尿尿症、杜杜氏肌营营养不良良症（DDMD）、葡萄糖糖-6磷磷酸脱氢氢酶（GG-6PPD）缺缺乏症、唐氏综综合症（DDownns synndroome）等等。根据不同同遗传疾疾病的分分子基础础，可采采用不同同的技术术方法进进行诊断断，不但但可
14、对有有症状患患者进行行检测，而而且对遗遗传疾病病家族中中未发病病的成员员乃至胎胎儿甚至至胚胎着着床前（ppreiimpllanttatiion）进进行诊断断是否携携带有异异常基因因，这对对婚育具具有指导导意义。地中海贫贫血（地地贫）是是世界上上最常见见和发生生率最高高的一种种单基因因遗传疾疾病（mmonoogennic disseasse）,由于一一种或几几种珠蛋蛋白合成成障碍导导致类类与类类珠蛋白白不平衡衡造成的的，临床床以贫血血、黄疸疸、肝脾脾肿大及及特殊外外貌为特特征，地地贫最常常见的有有两类：地贫贫和地地贫。地贫(-tthallasssemiias)的分子子基础主主要为珠蛋白白基因缺缺
15、失，也也有部分分病例是是由于碱碱基突变变造成的的。可采采用限制制性内切切酶图谱谱方法检检测珠珠蛋白基基因的缺缺失。人珠蛋蛋白基因因簇位于于16号号染色体体，长度度29 kb，包包含7个个连锁的的类基基因或假假基因。基因因（11及22编码序序列相同同，仅非非编码序序列稍有有差别,产物相相同），该该基因簇簇上有22个EccoRII识别位位点，经经EcooRI酶酶解，进进行Soouthhernn印迹，用用标记的的基因因片段作作探针，得得到一条条23 kb的的杂交条条带，BBamHHI识别别位点有有4个，但但只有114 kkb片段段能与mmRNAA基因探探针杂交交，见图图21-5。Hb BBartts
16、胎胎儿水肿肿综合征征：由于于该病患患儿二条条16号号染色体体的4个个珠蛋蛋白基因因均缺失失，不能能合成链，胎胎儿全身身水肿、肝脾肿肿大、四四肢短小小，常于于妊娠330440周死死亡或早早产后半半小时内内死亡。样本DDNA经经限制性性内切酶酶图谱分分析不能能显示珠蛋白白基因区区带，RRNA诊诊断也测测定不出出有珠珠蛋白基基因的mmRNAA。缺失型HHBH病病：由于于一条116号染染色体上上的两个个珠蛋蛋白基因因均缺失失，另一一条166号染色色体上则则缺失一一个珠珠蛋白基基因，并并缺失33.7 kb长长度的DDNA片片段（右右侧缺失失型）或或4.22 kbb片段（左左侧缺失失型），DDNA诊诊断只产产生199 kbb长度的的EcooRI片片段，或或10kkb BBamH
