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1、微机模拟蛋白质纯化实验一、实验目的：1. 了解模拟生化干实验的方法和意义，掌握用pro tein软件提纯蛋白质的方法。2. 进一步熟悉层析、热变性、盐析等常用生化分离方法的原理和应用。二、实验原理：“Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋白。任务要求利用软件提供的几 种实验技术，提纯每一个目的蛋白，最终达到单向电泳一条带，双向电泳一个点，而且使用 的人时和经费（根据提取步骤计算得到）不得超过一个特定值。在每个任务开始时，软件给出 目的蛋白的一些性质，如热稳定的温度范围和pH稳定范围等，利用这些信息，可以使实验少 走弯路。“Protein”提供的分离纯化方法有七种：热变性；硫铵
2、沉淀；排阻层析（凝胶色 谱）；离子交换层析；吸附层析；聚焦层析；制备电泳。在“Protein”所提供的各种分离纯化方法中,热变性法和盐析法是比较好的粗提方法, 在提纯的早期使用效果较好。层析是各种方法中最强有力的方法,制备电泳虽然纯化倍数高, 但是回收率低。在各种层析方法中，又以离子交换层析最为有效和易于使用，并且耗费的人 时和经费也较少。排层层析和聚焦层析耗费较大，但在某些特定情况下，这两种方法是不可 替代的。“Protein”提供了四种电泳方法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。 这些电泳方法不但可以用以检测样品的纯度，而且也给出了样品的一些信息，如分子量、等 电点等
3、，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以用于制备。本实验要求完成实验软件中三种酶的分离纯化。1 酸性条件下稳定的蛋白（Windows 3号酶）3号酶在62C以下稳定，稳定pH范围3.85.8 （酸性条件）。分离纯化步骤:1热变性：水浴温度61 C，水浴时间60min-ERJ 人”*亠离子交换：SESephadex C-20 柱朕二lOcui 直径二-2cm 澹谨二-3inl/jiiin 缰冲: Cit rat e-HaOH-HCl _pH= 5.4 离子梯度.01 . 152离子交换：-鬥电泳谱圏mpH92400 -6G500 -Mr 44500 -30600 -2
4、1400-34.45.87.28.610然后进行PAGE和SDS-PAGE检测结果分析：在检测时出现两条带的时候可能是由于蛋白质的含有两个亚基。5电泳谱圏0Kactivity H样品PH梯度_ 3一 4.4一 5.8_7.2_8.6PI大概为5.6。左右2碱性条件下的稳定的蛋白（Windows 5号酶）1热变性发蹩娈性法：温度二52C水浴时间二60min2离子交换-E：pg缺=j7 7 = 7 -5离子交换： SE-Sephadex C-20 柱长二10cm 直赛二 2cjti孟谨二.3jnl/jiiin銀冲巌：磷酸二氮i甲-ITEHpH= 6. 8 藹子梯度.01 . 15 3电泳结果5电泳
5、谱囹WMWpH4： page 和 sds-page 检测5电泳谱囹萍品样品OK9250066500445003060021500结果分析：PI大约为7.0。检测结果发现两条提纯结果不是很理想白色条。2 碱性条件下稳定的蛋白（Windows 30号酶）30号酶在52C以下稳定，稳定pH范围5.510.1 （碱性条件）。分离纯化步骤 ：1热变性：水浴温度51C，水浴时间60min2硫铵沉淀：初始百分饱和度20%，终末百分饱和度65% (质量分数)，收集沉淀组分3离子父换层析：填料DEAESephadex A-50，柱长：10cm,柱内径:2.0cm,缓冲体系：磷酸氢二钠-Citrate(2.2 8
6、. 0), pH 6.4,流速：0.3ml/min, 离子强度梯度洗脱：0.01mol/L-0.15mol/L, 洗脱体积：300ml。收集从77100管的样品进行二维电泳分析：pH34.45.87.28.610924G0一開蛛一Mr 4450 -3060G -2140-因杂质蛋白与目标蛋白Mr相差较大，可用凝胶层析进行进一步分离D)凝胶层析：填料Sephadex G-75,柱长：100cm,柱内径：2.0cm,缓冲体系：磷酸氢二钠-Citrate(2.2 8.0) pH 6.4,浓度0.02mol/L，流速:0.3ml/min,收集后进行如下检测：检测纯化结果：A）二维电泳，pH 310,分离胶浓度20%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分 数）pH4 45.87.28.G W已达到一个点的要求。B）PAGE:分离胶浓度10% （体积分数），浓缩胶浓度3% （体积分数），缓冲体系: 磷酸二氢钾-NaOH, pH 8.0祥品OKactivity用PAGE检验，已达到一个点的要求，作为对比再用SDS PAGE检验。C）SDS-PAGE :分离胶浓度20 %（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数），祥品5160037700258001600012900SDS PAGE检验结果显示，有一条带。：实验结果分析：提纯效果比上两个好，只有一条白条。此蛋白质的PI约为6.8。
