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1、原花色素的提取及测定一、实验原理原花色素，也称原花青素，是一类从植物中分离得到的在热酸条件下能产生 花色素的多酚化合物，它既存在于多种水果的皮，核和果肉中，如葡萄，苹果， 山楂等。也存在于如黒荆树，马尾松，思茅松，落叶松等的皮和叶中。原花色素属于生物类黄酮,它们是由不同数量的儿茶素或表儿茶素聚合而成 最简单的原花色素是儿茶素的二聚体，此外还有三聚体，四聚体等。依据聚合度 的大小，通常将二至四聚体称为低聚体，而五聚体以上的称为高聚体。从植物中 提取原花色素的方法一般有两种，分别是用水抽提或用乙醇抽提。其抽提物为低 聚物，称之为低聚原花色素（OPC）。原花色素具有很强的抗氧化作用，能清除人体内过剩
2、的自由基，提高人体的免疫力，可作为新型的抗氧化剂用于医药、保健、食品等领域。利用低聚原花色素溶于水的特点，用热水煮沸抽提原花色素，再用大孔吸附 树脂吸附、洗脱得到原花色素。D101 树脂是一种球状、非极性交联聚合物吸附剂，具有相当大的比表面和 适当的孔径，对皂甙类、黄酮类、生物碱等物质有特殊的选择性，适用于从水溶 液中提取类似性质的有机物质。原花色素（I）的48连接键很不稳定，易在酸作用下打开。反应过程（以二 聚原花色素为例）是：在质子进攻下单元C8（D）生成碳正离子（II）, 48键裂 开，下部单元形成（-）-表儿茶素（山），上部单元成为碳正离子（IV）,失去一个质子成为黄-3-烯-醇（V）
3、,在有氧条件下失去C2上的氢，被氧化成花色素（VI）,反应还生成相应的醚（VII）。若采用正丁醇溶剂可防止醚的形成。（如下图所示）OHHOOHOHOH130.HOOHX “OHOHHORQHVII R=It.ELPr原花色素的酸解反应在一定浓度范围内，原花色素的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的原花色素含量。但盐酸-正丁醇法受原花色素的结构影响较大，对于低聚度原花色素及儿茶素等单体反应不灵敏。二、实验器材新鲜山楂，烧杯，玻璃层析柱，大孔吸附树脂D-101,具塞试管*9,移液枪，紫 外分光光度计，水浴锅；三、实验试剂60%乙醇，95%乙醇，原花色素标准品（1.0mg/mL）, HC
4、I-正丁醇，2%硫酸铁铵， 2.0mol/L HCl；四、实验步骤I原花色素的制备1、称取新鲜山楂10.0g，剪成块状，置入锥形瓶中，加入40.0mL蒸馏水，沸水 浴30min，间期混匀。冷却后加入20mL蒸馏水，过滤（或离心），滤液备用。2、取一根层析柱（1.5*20cm）,洗净，竖直装好，关闭出口，加入蒸馏水约1cm 高，用烧杯取一定量已处理好大孔吸附树脂D-101,搅匀，沿管内壁缓慢加入, 待柱底沉积约1cm高时，缓慢打开出口，积蓄装柱至高度10cm，液面高于树脂 约 3cm。3、平衡：用蒸馏水洗2 倍柱床体积，控制流速在 1mL/min 左右，至洗出液的 pH 呈中性。4、滤液上样，上
5、样时控制流速在2mL/min。上完样后，先用蒸馏水洗两倍柱床 体积，然后换60%乙醇进行洗脱，控制流速在1mL/mi n。待有红色液体流出时开 始收集，直到收集到无红色为止。5、将收集液用60%乙醇定容至50mL，作为下次测定的样品。II原花色素的测定1、制作标准曲线：取干净试管7支，按表1进行操作，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度为横 坐标作图得标准曲线。2、样品含量测定分别吸取样液0.10mL, 0.20mL置于两支试管中，按表1操作。表1管号试剂/mLX012345样品6样品7OPC标准液00.100.150.200.250.300.100.20乙醇0.500.400.350.300.25
6、0.200.400.302%硫酸铁铵0.100.100.100.100.100.100.100.10HCl -正丁醇3.403.403.403.403.403.403.403.40沸水浴30min取出，冷水冷却15min后测定。OPC含量/ug0100150200250300五、实验结果表2管号012345样品6样品7OPC含量/ug010015020025030065.6132546nm00.3470.4730.7040.8130.8850.2210.444HCI-正丁醇法测定原花色素含量标准曲线rAV 0 003311 x + 0 003811卫”拿7R2=0.99338305010015
7、0200250300350OPC 含量/|!g0.90.8吸光度0.70.60.50.40.30.20.10由于（300，0.885）一点明显偏差较大，在作图时剔除这一点，得到以上标准曲线，根据标准曲线计算得到以下结果：表3管号样品6样品7样液/mL0.100.20”546nm0.2210.444OPC含量/ 口 g65.6132原花色素样品的百分比含量0.328%0.330%相对相差0.006平均值0.329%六、分析与讨论1、本次实验测得原花色素的百分含量为0.329%，两份样品的平行性较好。剔除 最后一个点以后作出的标准曲线的线性也较好，实验较为成功。2、作标准曲线时，最后一点偏离直线原因可能是此时色素浓度太大，与 LambertBeer 定律出现了负偏差，导致浓度过大时与吸光度不再呈线性关系。3、山楂的原花色素主要存在于果皮中，果肉中也含有部分，但含量较少。实验 中部分同学在取材时只使用了山楂皮，故最终测得的原花色素含量较高。这启发 我们如果在生产中以山楂为原料提取原花色素，为求产量高，应尽量多用山楂皮。
