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1、广州大学综合设计性实验报告课程：微生物实验 实验课题：土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶 活力的测定学院：生命科学学院姓名：徐嘉宽学号：1414300030班级：生技142小组成员：一 实验摘要本次实验通过采用5点采样方法在校园中采取2处土壤样品，运用梯度稀释的方法分离培养出不同生长形态的细菌，镜检后挑选几个菌落进行纯培养，用淀粉培养基鉴定其是否产淀粉酶，通过单染色、芽孢染色、革兰氏染色确定菌株的形态及革兰氏阴阳性，再通过各种生化试验鉴定菌株的特性，确定了我们所分离的2株菌株其中一株为蜡状芽孢杆菌。二 实验目的1. 掌握从土壤等复杂的微生物环境中分离纯化技术2. 掌握培养基的配置方法及常用的
2、微生物培养方法3. 掌握常用的微生物形态学鉴定方法、生理生化鉴定方法4. 了解微生物的16SrRNA序列鉴定方法、免疫学鉴定方法5. 掌握淀粉酶活力测定的原理及方法6. 掌握菌种保藏技术7. 培养数据统计、分析能力8. 培养团队协作精神，增强沟通合作能力9. 与其他小组交流合作、数据共享，进行更深入的探讨10. 学会查找、收集、整理资料三 实验原理芽孢杆菌(BaciUus)是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。这类细菌多数为腐生菌,主要分布于土壤、植物体表面及水体中,由于它们能够产生对热、紫外线、电磁辖射与某些化学药品有很强抗性的芽孢,因此能忍受多种不良环境。土壤中蕴含着丰富的微
3、生物资源,芽孢杆菌是其中具有重要应用价值的微生物类群。有些菌种可以分泌多种酶,可应用于工业生产;有些菌种能产生对昆虫毒性较强的蛋白,可生产微生物农药;有些菌种可作为多种分泌蛋白基因表达受体,在基因工程领域中有较高的应用价值。土壤具有微生物进行生长繁殖与生命活动中所需的各种条件，是微生物生活最适宜的环境。其中的微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10cm30cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少。淀粉酶是水解淀粉与糖原酶类的总称,是用于酿酒、食品、医药、纺织、饲料等具有商业价值的重要酶类。广州
4、大学城四面环江，地处南亚热带,其气候属南亚热带典型的季风海洋气候。芽孢杆菌资源非常丰富。本方案在广州大学城预定区域釆集土壤样品,采用纯培养的方法,分离获得芽孢杆菌。对菌株进行形态学观察及生理生化分析,以挑选出可产淀粉酶的菌株。四 实验材料1. 试剂与配方试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、葡萄糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O、95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水等工具:取样：铁锹、尺子、塑料袋等培养：接种环（针）、培养皿、试管、试管架、锥形瓶、塞子、标签纸、打火机、酒精灯、报纸、橡皮筋、无菌棉签、载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、精密pH试纸
5、、吸水纸、培养基平板，无菌水，试管架，酒精灯，酒精瓶，记号笔，废物缸，牙签等；其他工具：无菌操作台、恒温振荡培养箱、恒温培养箱配方：1) 牛肉膏蛋白胨培养基：营养琼脂3.3%、蒸馏水100mL、pH7.2-7.4。2) 营养肉汤:牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、蒸馏水100ml、pH（5.7、7.2对照）。3) 半固体培养基(运动性试验）: 琼脂0.5%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、蒸馏水100ml、pH7.2-7.4。4) 酪素水解培养基（酪素水解试验):取5g脱脂奶粉与一号三角瓶中，加入50ml蒸馏水，110灭菌。另称1.5g琼脂置于含50mL蒸
6、馏水的二号三角瓶中,120灭菌,待冷至45-50C时,将两液混匀倒成平板,即为牛奶平板。将平板倒置过夜,使表面水分干燥。5) 淀粉水解培养基:营养琼脂3.3%、可溶性淀粉2%、蒸馏水100ml、PH7.2-7.46) 卵黄反应培养基：无菌条件下去卵黄加等量的生理盐水，摇匀后，取5ml加入到融化的约 50-55的100ml的营养琼脂中（内含1g葡萄糖)，混匀后倒入培养皿内。制成的卵黄平板过夜后即可使用。7) 硝酸盐还原实验培养基:胰蛋白胨1.0%,酵母浸粉0.5%,NaCl 1.0%, KN03 0.1%,蒸馏水 1OOmL,调节pH7.0。8) 发酵培养基:玉米粉2%、黄豆饼粉1.5%、CaC
7、l2 0.02%、MgSO4 0.02%、NaCl 0.25%、K2HPO4 0.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸氨0.075%(溶解后加)、Na2HPO4 0.2%,pH值7.0。9) 明胶培养基：NaCl 0.5%、蛋白胨1.0%、牛肉膏0.3%、明胶12%、蒸馏100mL，调pH 7.2-7.4。10) 西蒙斯氏柠檬酸钠盐培养液：柠檬酸钠0.2%、NaCl 0.5%、MgSO40.02%、磷酸二氢钾0.1%、磷酸氢氨0.1%、 溴麝香草酚蓝水溶液1ml、琼脂2%、蒸馏水100ml、PH7.2-7.4。11) 耐盐试验培养基（2%、5%、7%、10%）：营养琼脂3.3%、NaCl（0.2%、0
8、.5%、0.7%、1.0%）、蒸馏水100ml、PH7.2-7.4。12) 糖发酵培养基（110灭菌）12-1葡萄糖发酵培养基：葡萄糖1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。12-2乳糖发酵培养基：乳糖1.5%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。12-3木糖发酵培养基：木糖1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。12-4阿拉伯糖培养基：阿拉伯糖1.0%、蛋白胨0.2%
9、、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。12-5甘露醇发酵培养基：甘露醇1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。13) 葡萄糖蛋白胨培养基(VP、MR试验）（110灭菌）：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、NaCl 0.5%、PH7.2-7.4。14) 蛋白胨水培养基（吲哚试验）：蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、PH7.2-7.4。15) 酪氨酸培养基（酪氨酸水解试验）：L-酪氨酸0.5g悬浮于10ml蒸馏水中，20min 110灭菌，与100ml无菌营养琼脂混
10、合，即成酪氨酸水解平板。16) 1% 麦芽糖溶液取0.1g麦芽糖,加入蒸馏水定容至100ml。17) 0.85%无菌生理盐水称取0.85g NaCl于100ml蒸馏水中，摇匀，120灭菌。18) 1% 3,5-二硝基水杨酸试剂称取1 g 3,5-二硝基水杨酸,溶于20 ml浓度2 mol/L氢氧化钠溶液中,加入50 ml蒸馏水,再加入30 g四水酒石酸钾钠(C4H4KNaO64H2O),待溶解后用蒸馏水定容至100 ml,盖紧瓶塞,勿使CO2进入。19) 2%淀粉溶液:称取2 g可溶性淀粉溶于100 ml浓度0.1 mol/ml pH值5.6柠檬酸缓冲液中。20) 生化鉴定：草酸铵结晶紫染色液
11、、路哥氏碘液、95%乙醇、0.5%番红染液、香柏油、二甲苯、乙醚、碘液、吲哚试剂、40%KOH、5%-萘酚溶液、甲基红试剂等五 实验步骤1.土壤取样分别在网球场旁的草地与体育馆后面的草地采集5-20深度的土壤，五点采样，依次编号“1、2、3”样品装在无菌纸袋中。分别标记为样品一与样品二。记录采样时间、地点、环境、土壤类型、pH等。样品4保存备用。2.分离纯化称取5 g 土样加入45 mL无菌生理盐水中,混勻，80C水浴30min,以杀死无芽孢细菌。10倍梯度稀释10-2-10-5倍。用一支新的无菌枪头从各浓度土壤稀释液中分别吸取0.2 mL涂布于已标记好稀释度的牛肉膏蛋白胨培养基上,每个浓度梯
12、梯度取两个重复,标记日期、时间、组别，置于37培养箱中培养24h。观察已培养的细菌，将形态不同的菌落在皿底用记号笔编号“A01、A02、A03”后，进行划线纯化。先在已经平板培养基的一边作第1次平行划线34条，再转动培养皿约60角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线，再用同法通过第2平行划线部分作第3次平行划线与通过第3次平行划线部分作第4次平行划线。划线完毕，在培养皿底部与顶部写上菌落编号与对应的纯化次数“A01-1、A02-1、A03-1”。标记日期、时间、组别后，将培养皿倒置于2829恒温培养箱中培养约20h。再继续分区划线2次，以获得较纯的菌种。每次划线
13、完毕，在培养皿底部与顶部写上菌落编号与对应的划线次数，标记日期、时间、组别。注意观察记录菌落形态、表面及边缘特征等，为“4.3、初步鉴定”提供基础。纯化三、四次后镜检，挑取纯化的菌种进行单染色，观察细菌是否为杆状，以及细菌的大小、两端形态、粗细、着色深浅等是否一致。若不全为杆状，则弃用，若个体形态不一致，且形态不一致的两种或多种细菌数量相当，则再次纯化，直至个体形态一致。3.产淀粉酶芽孢杆菌的筛选用接种沾取纯化的菌落分别点种到含淀粉培养基的无菌平板上，并标记菌落编号、日期、时间、组别，放置在37恒温培养箱中培养48h。取出平板滴加路哥氏碘液，缓慢摇晃至碘液将平板覆盖均匀，静置，产生透明圈的菌株
14、初步定为淀粉酶产生菌株!同时，测定产生透明圈的宽度，选择比较大的且菌落形态不同的两株菌株进行芽孢染色与革兰氏染色。从试管中沾取备份菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基，37培养12h进行革兰氏染色，培养24h进行芽孢染色。若未观察到芽孢，挑取与之前挑取位置不同位置的菌落再次染色观察。若仍未观察到芽孢，从试管中挑取形态与选取的菌株不同的菌株进行活化、染色。4.单染色方法：1、涂片：用1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充分混匀涂成薄膜。2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。4、染色：待玻片冷却后加结晶紫（
15、或者石炭酸复红）1-2滴于涂片上，覆盖涂面染色1-2分钟。5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的水变无色为止（注：勿冲去菌体）。6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。7、镜检：油镜观察并绘图。将纯化得到的单菌落分为两份，其中一部分接种于试管斜面培养基37培养24h后，于4保存备用，每个菌株做两个重复备份，将菌株的原有编号中的A替换为B，添加重复序号后编号，如“B01-3-1、B01-3-2、B02-3-1”；另一部分用来做产淀粉酶的芽孢杆菌筛选。5.芽孢染色方法：1、 涂片、干燥及固定2、加温染色：加5%孔雀绿染色液于玻片上，微火加热至冒蒸汽维持5分钟。3、水洗 将玻片冷却，水洗直到流出的水中无绿色为止。4、常温复染：加番红染色2分钟后，倾去染色液，水洗，直接用吸水纸吸去余水。5、镜检：用油镜观察。记录结果。6.革兰氏染色方法：1. 涂片、干燥及固定2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1-2分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约25秒，后立即用流水冲洗。5. 复染：滴加番红染色液，染2分钟，水洗后用吸水纸吸干。
