《农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证》由会员分享，可在线阅读，更多相关《农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、农杆菌电击感受态的制备及电击转化表达载体pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的农杆菌(EHA105)电击转化(1)抽提纯化pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的重组质粒pB-2mb-FRO-1.7A重组载体和pB-2m卩-1.7A空载体的(DH5a)菌种接种于5mlLB(含卡那霉素50mg/L)液体培养基中，37C,200rpm震荡培养过夜。按V-GENE公司的质粒提取试剂盒提取pB-2mb-FRO-1.7A重组质粒。(2) 取200ml型号的电击杯用无水乙醇浸泡，晾干。(3) 农杆菌EHA105电击预备处理。I. 接种于5mlYEP(含链霉素S
2、m50mg/L)液体培养基中，28C,200rpm震荡培养过夜至OD6OO值为0.4。EHA105II. 离心管中收集1ml菌液，4C,8000rpm，离心30s。1.5mlIII. 去残液，沉淀用200卩1ddH2O充分悬浮，4C,8000rpm，离心30s。IV. 重复步骤iii三次。V. 去残液，沉淀用200mlddH2O充分悬浮，即为电击用农杆菌EHA105感受态。加入200卩1灭菌甘油混匀后置于-80C备用。(4) 电击I. 分别取10mlpB-2mb-FRO1-1.7A和pB-2mb-1.7A重组质粒至200卩1EHA105感受态中，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。II. 准
3、备好电击装置(BioRad)，电压为2.5V，用手按住电击按钮，直到啪的一声电击完毕。III. 室温静置2min后加入800mlYEP培养液，28C静置1h,然后28C，200rpm培养2h。IV. 离心30s,收集菌液，沉淀用200mlddH2O悬浮，用玻璃棒涂布含含卡那霉素50mg/L和含链霉素Sm50mg/L的YEP固体培养基平板，28C培养48h。8000rpm1. 制备农杆菌电转感受态(1)挑取根癌农杆菌EHA105单菌落，接种于5mlLB含利福平(Rif)50mg/L,；链霉素100mg/L)液体培养基中，28C,220rpm震荡培养过夜。将2m1过夜培养的菌液加到50ml含同样抗
4、生素的LB培养基中，28C,220rpm震荡3-4小时，至OD560=0.5左右。(3) 5000rpm离心5分钟，去上清。(4) 加入40m110%甘油悬浮菌体，冰浴30min.(5) 4C,5000rpm离心5分钟，去上清。(6加入30mL10%甘油重悬浮菌体，4C,5000rpm离心5分钟，(7)重复步骤6一次，去上清，加入2ml10%甘油悬浮，分装于1.5ml的离心管中(200p1/管)备用。2农杆菌感受态的电转化I)取2ul质粒加到200uIEHA105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。(2) 把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化。(3) 马上加入lml新鲜的LB液体培养基，
5、28C,150rpm轻摇4-6小时。(4) 收集菌体涂布于含有链霉素100mg/L),利福平(50mg/L)及质粒所含的抗性的LB固体培养基平板上，28C培养2-3天。其实和大肠杆菌电转化差不多，只不过培养温度是28度，摇的时间长一些，还有就是链霉素和利福平两种抗生素要加上，目的是防止根癌脓杆菌自带质粒的丢失，不过具体要加哪些抗生素还得看你是那种根癌脓杆菌非常感谢我用的不是电转化是把茎和叶浸在农杆菌液里30秒.想知道为什么不是把菌液直接滴在土里?可以采用注射法导入农杆菌还有就是把植株取出放入侵染液中用真空渗透法导入感受态制备及转化1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农
6、杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50/ml28C培养。3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3mlLB液体培养基中，220rpm28C振荡培养至0D600=0.5。2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5ml0.5MNaCl悬浮，冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液
7、；6）每管用100l20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4C保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70C保存。使用时从一70C取出，置冰上融化后使用。4、DNA直接转化农杆菌：1）50农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA0.11（510ul）,之后冰浴30min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37C水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入0.5mlLB，28C、220rpm振荡培养35hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28C条件下倒置培养。2天左右菌落可见。（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan+Rif/Str；pTCK载体：Kan+Rif/Str
