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1、产蛋白酶的菌株初筛吴建新温俊国王文(山西大学环境与资源学院)摘要：探究胞外蛋白酶的初步筛选方法和找到相对应的产蛋白酶的菌株。取养鸡场的 鸡粪，采用含脱脂奶粉的菌种筛选培养基和梯度稀释法涂布培养基，接不同浓度的菌种于培 养基中并且设置阳性对照。鸡粪中含有产蛋白酶的菌种，且在浓度为10-4中菌种分布较好，10 -3较多，10-5较纯。利用含脱脂奶粉的筛选培养基中可以初筛到鸡粪中的产蛋白酶菌株。 关键词：细菌；初筛；鸡粪；产蛋白酶The production of protease by strain screeningSharui Ma jiangbo Meng fanjian Sun xiaof
2、ei(College of resource and environment, Shanxi University)Abstract: Objective To explore the preliminary screening method of extracellular protease and find corresponding protease producing strains. Methods The farm manure, with skim milk screening culture medium and the gradient dilution coating me
3、dium with different concentrations of bacteria, to cultivate the positive control and set the medium. The results of chicken manure containing protease producing strains, and10-4 the concentration of species distribution better,10 -3 more, 10-5 more pure. Conclusion Screening using skim milk medium
4、screening to the protease producing bacteria in chicken feces.Keywords: bacteria; screening; chicken; protease蛋白酶是催化肽键水解的一类酶,是一 种 重 要 的 酶 制 剂，蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选 择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子 中一定的肽键，有专一性，因此，在食品、 洗涤、医药、制革等工业中用途非常广泛。 碱性蛋白酶是蛋白酶中应用较多的一类，在 轻工、食品、医药工业中用途十分广泛，其 分布于动物、植物及微生物 1. 1 土样 本实验所用含有鸡粪的土样来 源于太原养鸡
5、场。碱性蛋白酶 最早发现于猪胰脏中，是一类最适pH偏碱 性、适于在碱性条件下水解蛋白质的酶类。 今年来工业产酶微生物，在洗涤、制革、食品等行业得到了广泛的应用(3-4)。本实验对 鸡粪中常温下产蛋白酶细菌的筛选方法，筛 选出何种梯度稀释下菌落生长和分布的较 好，为进一步复筛高产碱性蛋白酶提供合适 的菌种。1材料和方法1. 1材料1. 1. 2培养基 普通肉汤蛋白胨培养基： 牛肉膏3g蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂 18g水 1000ml pH 7.0一7.2 121 度灭菌 20min 脱脂奶粉用无菌水溶解后在0.06MPa下灭菌 30min,制成15%的牛奶1. 2方法1. 2. 1牛奶
6、平板：脱脂牛奶用水溶解为 15%的后单独灭菌，再铺平板时，取22.2ml 的灭菌牛奶与加热熔化的200ml普通肉汤蛋 白胨培养基混合使其变为终质量为1.5%的 牛奶。1. 2. 2制备土样稀释液：称取土样10g。 放入盛90mL的无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶中，震荡约20min，使土样与水充分混 合，使细胞分散。用一支无菌水移液管吸取 1ml 土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管 中充分混匀，1. 2. 3对照组：在其中的两个培养基的 平板底部或培养皿盖周边用记号笔分别写 上对照一和对照二。利用无菌操作技术，用 接种环在地衣的培养基中取菌后均匀的接 种出五个点于对照一的培养基中。在无菌操 作
7、技术下，在斜面试管培养基上用接种环轻 轻的刮取几下，将2ml的无菌水倒入该试管 中，制成菌悬液后，用无菌吸管吸取0.2ml 于对照二的培养基中央位置用无菌玻璃棒 在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将 菌液沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布 均匀，然后改变方向90沿另一垂直线来回 推动，平板边缘处可改变方向用涂棒再涂布 几次，室温下静置510分钟。盖周边用记号笔分别写上（1）10-3，（2）10-3，（1） 10-4，（2） 10-4，（3） 10-4，（4）10-4，（1）10-5和（2） 10-5这几种稀释字样。然后用无菌吸管分别有10-1、。-2、0-3和10-4 4管土壤稀释液中的 吸
8、取适量对号放入写好稀释度的平板中央 位置，每皿准确放入0.2ml,用无菌玻璃棒 在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将 菌液沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布 均匀，然后改变方向90沿另一垂直线来回 推动，平板边缘处可改变方向用涂棒再涂布 几次，室温下静置510分钟。1. 2. 4涂布：将上述每种培养基的平板底部或培养皿此为10 -1稀释液，以此类推制成10-2,10-3,10-4和10-5几种稀释度的土壤溶 液。1. 2. 5培养：将上述10个含有牛肉汤蛋白 胨的培养基的平板倒置于恒温箱中培养24 小时左右。1. 2. 6观察：24小时后，取出10个培养基， 并用肉眼直接观察实验组与对照组的
9、现象， 并把有水解圈的实验组的菌落接种到培养 基中，以备后面的复筛。2结果与讨论2. 1产胞外蛋白酶菌株的初筛：2个对照培养基中，利用5点接种环接种中 其中5个菌落，有2个长出水解圈。利用菌 悬液涂布的有130个菌落，有1个长出水解 圈。8个实验培养基中，两个10-3浓度的培 养基中，189个菌落中没有水解圈的产生， 另一个132个中有4个菌落长出了水解圈。在4个10-4浓度的培养基中，其中一个100 个菌落中没有水解圈的产生，一个112个菌 落中有3个产生了水解圈，一个105个菌落 中有2个产生了水解圈，最后一个100个菌 落中有1个产生了水解圈。两个10 -5浓度的 培养基中，有一个37个
10、菌落中产生一个水 解圈，另一个40个菌落中没有水解圈的产 生。2. 2实验组中产生水解圈的菌落的菌落直径 和水解圈的大小表示浓度10 -310 -410 -410 -512341231231水解 圈大 小cm1.501.501.551.551.401.301.301.351.451.501.30菌落 直径 大小cm0.800.600.700.600.650.600.600.600.400.450.602. 3实验组产生水解圈的水解圈与菌落直径 的比浓度10 -310 -410 -410 -512341231231水解圈与菌落直径的比1.872.502.212.582.152.172.172.2
11、53.633.332.17中蛋白酶的菌种，并且通过分析结果可知浓度为10-4时的菌落的分布较好且有最大水解圈，浓度为10-5时菌落少易于分离，但浓度为10- 4菌种形态的观察：通过肉眼可以直接观 察到，一种菌落直径大而且菌体发白色，另 一种直径小而且菌体显示绿色。而且两种的 水解圈与菌落直径的比值分布不同，菌落菌 落直径大而且菌体发白色的比值偏大，直径 小而且菌体显示绿色的比值偏小。 2. 5讨论：由于菌液浓度的不同，导致所得 的菌落的密度不同。其次由于对照组设计的 问题，因此与实验组的对比不明显，可比性 较差。实验组设计中因为认为接种差异，导 致有些合适的浓度的培养基并未出现水解 圈。3结论
12、：本实验通过对胞外蛋白酶的初步筛选，利用 梯度稀释法涂布培养基，获得了能水解牛奶时菌落生长较多。可以初步确定最 适合的浓度通过下一步的复筛，将能水解蛋 白的菌落筛选出来，分离蛋白并提纯。也可 以通过水解圈的大小和菌种肉眼可以观察 的形态和颜色，初步判断，在这些菌种中， 可能存在至少两种能水解蛋白的菌种，一种 是水解圈与菌落直径的比在1.252.50左 右，另一类是2.754.67左右，但本实验没 有进行温度，pH,等条件的设置，因此不能确定不同分解菌种的适宜生长条件，进而无 法分析出具体有几种可以水解蛋白酶，产生 蛋白酶。参考文献：(1)唐兵,周林峰，陈向东,等嗜热脂肪芽 抱杆菌高温蛋白酶的产
13、生条件及酶 学性质J 微生物学报,1999,(2 )沈萍，陈向东等微生物学实验 2007年11月第4版(3)SUNDARARARAJAN S, KANNAN C N, CHITTIBABU S.Alkaline protease from Bacillus cereus VITSN04: Potential application as a dehairing agentJ.Journal of Bioscience and Bioengineering, 2011,111 (2):128-133(4) ESPOSITO T S, AMARAL I P G, BUARQUE D S. Fish processing waste as a source of alkaline proteases for laundry , detergentJ.Food Chemistry,2009, 112:125-130
