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1、实验十一 细菌质粒DNA的提取和纯化一、实验目的：通过细菌质粒DNA的提取，掌握共价闭合环状DNA的提取方法。二、实验原理：1、细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。2、质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。3、碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在
2、上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在实验室中常用。三、 实验材料：含有PMD19质粒的大肠杆菌（E. coli.）菌液四、实验用具和药品：实验用具：摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管（15mL
3、）及塞子、离心管（1.5mL）。实验药品：溶液（高压灭菌）： 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Cl（pH8.0） 10 mmol/L EDTA（pH8.0） 溶液（现用现配）： 2 mol/L NaOH 10% SDS（十二烷基硫酸钠） NaOH： SDS：ddH2O=1:1:8溶液：5 mol/L乙酸钾 60mL冰乙酸 11.5mL水 28.5mL 五、实验步骤：（一）细菌繁殖 第1天晚上： 吸取含质粒的菌液2L，转移入2mL LB（加入相应抗生素），37，过夜振荡（200r/min）培养。（二）菌体收集 第2天早晨(时间:约2-3h左右)： 1、将过夜培养的菌体转
4、入1.5mL离心管，5000r/min离心30sec；2、弃上清（三） 碱裂解法提取质粒DNA1、将上述沉淀重悬于100L冰预冷的溶液中，剧烈震荡（须使沉淀完全分散） (葡萄糖：悬浮细胞；EDTA；抑制DNAase)2、加入200L溶液，盖紧管口，轻柔颠倒离心管510次，该过程应小于5min；（NaOH：溶解细胞膜，释放DNA；SDS） 3、加入150L冰预冷的溶液，盖紧管口，温和地颠倒离心管510次，该过程大于5min；（乙酸钾 ：和SDS 反应生成PDS（十二烷基硫酸钾），沉淀蛋白，同时体积较大的染色体DNA也一起沉淀；冰乙酸 ：中和NaOH ）4、10000r/min离心5min；5、上
5、清转移到另一新1.5mL离心管中；6、加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，室温放置2min（若沉淀不充分，可加入1/10体积3mol/L的醋酸钠）；7、10000r/min离心5min；9、 弃上清，干燥沉淀；9、加TE溶解沉淀，保存。六、实验作业：思考本实验的关键步骤是什么？答：本实验的关键是溶液重悬须充分，溶液混合须温和。碱裂解法的关键是如何把握SDS-NaOH处理的时间。质粒制备过程中，如果质粒长时间暴露于NaOH, 质粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。这些变性质粒，不能酶切。所有一般情况下，SDS-KOH处理时间不能超过5分钟，最好在冰里处理，观察到液体变得清就可以加入
6、中和液。七、注意事项：1、质粒的选取，尽量选择较小的松弛型质粒。2、提取过程应尽量保持低温。3、溶液II不可冷冻,现用现配，加入溶液2后不要剧烈振荡，只需轻轻颠倒几次离心管。复性时间不宜过长，一般是5分钟，否则会使染色体复性。4、沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。5、应用TE缓冲液溶解沉淀是为了在用苯酚、氯仿抽提时，以减少DNA的损失。6、50%的乙醇可溶解DNA,故应该极其注意70%的乙醇是否盖子完好,否则稀释的乙醇有可能将所获得DNA溶解掉。八、讨论与小结
7、：1.为什么用无水乙醇沉淀DNA？ 用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67左右。因而也可改用95乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95乙醇昂贵）。但是加95的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀D
8、NA时可用95乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置1530分钟即可。 2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.10.25mol/L？ 在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。本次实验是能动性、严谨性很强的实验，因此通过这次实验，我们能把理论和实践更好的联系在一起，将将理论应用到实践，提高了自己的实验能力，同时也加深理论的理解。要成功完成实验，必须理论知识丰富，全面了解可能导致实验失败的因素，在试验中特别注意。时刻规范操作，否则容易导致实验失败。
