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1、生物技术制药实验武汉大学药学院 生物技术实验室湖北武汉目 录实验一 质粒DNA的小量制备2实验二 质粒DNA电泳鉴定4实验三 感受态细胞的制备和转化5实验四 目的基因的表达及表达产物的初步提取8实验五 蛋白质纯化盐析沉淀法10实验六 凝胶过滤层析14实验七 蛋白质免疫印迹实验（Western Blotting）16实验八 HRP结合物的过碘酸钠交联法19 实验一 质粒DNA的小量制备【目的】学会最常用的碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。【原理】 根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这样的条
2、件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA等发生共沉淀下去而被去除。【器材】超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。【试剂】pET-28a质粒载体菌, LB培养基1000ml（含10mg/ml卡那霉素），葡萄糖/Tris/EDTA 溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液 （溶液 II），KAc溶液（pH4.8
3、）（溶液 III），RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。【实验准备】 1. 配制卡那霉素储存液（无菌水配制10mg/ml，分装后-20C保存）。2. 配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL 双蒸水搅拌完全溶解，用约200mL 5N NaOH调pH至7.0，加双蒸水至1L，121C灭菌20min）。3. 溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）。溶液可成批配制，每瓶约100ml,在高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4。溶液II（0.2mol/L
4、 NaOH，1% SDS）；溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补双蒸水至100ml）。4. 70%乙醇（-20C保存）。5. TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA ，pH8.0）。6. 试管洗净并塞上棉塞，1.5ml离心管装入灭菌盒，移液器吸头装入相应的吸头盒，高压灭菌（121C， 30min）。【操作步骤】1. 在超净工作台中取5ml LB（Amp+），加入灭菌的试管中。2. 取出保存的携带pET-28a质粒的菌种, 在超净工作台上用接种环移取少量菌种至5ml无菌的LB培养液（含10ug/ml卡那霉素）中
5、，37C摇床中振荡培养20h。3. 取1ml的菌液至1.5ml离心管中，12000 rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。4. 在沉淀中加入预冷的100ml 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。须确使细菌沉淀在溶液中完全分散。5. 加入200ml 溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管次。应确保离心管的整个内表面均与溶液接触。切勿剧烈振荡。冰浴中放置5min。6. 加入预冷的150ml 溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，冰浴放置5min。7. 12000 rpm离心5min，小心吸取400ml 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物
6、带入！），加入800ml 95% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。8. 12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入500ml 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，倒置尽量流尽。9. 再加入500ml 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净，可将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。10. 离心管倒置于37C温箱中（或室温）空气干燥10分钟。11. 加入10mLTE缓冲液，涡旋混合器上轻微振荡混匀，离心机中瞬时离心将溶
7、液收集于管底。用记号笔标记后放入冰箱中冷藏待电泳确认。12. 在剩余的菌液中倒入少许新洁尔灭，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下水池。清理桌面，清洗仪器。13. 撰写实验报告。【思考】影响本实验结果的主要因素有哪些？实验二 琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA【目的】学会常用的琼脂糖凝胶电泳法分离和鉴定DNA。【原理】DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。【器材】电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取
8、样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。【试剂】 pET-28a，TAE电泳缓冲液，1000溴化乙锭储存液，电泳级琼脂糖粉，10加样缓冲液（或6加样缓冲液），DNA分子量标准（DNA Ladder:100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500 bp）。 【实验准备】 配制TAE电泳缓冲液（50储存液，pH约8.5：Tris碱 242g，57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，dd water 定容至1L）；1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml：50mg溴化乙锭溶于100mL 双蒸水，4C避光储存）；10加样缓冲液（
9、20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝）；6加样缓冲液；1.5ml离心管装入灭菌盒，移液器吸头装入相应的吸头盒，灭菌。【操作步骤】1. 称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml TAE电泳缓冲液(1)，放入微波炉中加热溶解（1min）。注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。2. 戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致50-60C（手接触瓶壁不感觉烫）。3. 把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。
10、静置10-20分钟待胶完全凝固。在水平电泳槽中加满1TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。4. 待胶完全凝固后（15-20分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。5. 剪1片光面纸（或封口膜），点6ml蒸馏水、1ml 10加样缓冲液，再加入3ml质粒DNA溶液制成10ml DNA样品。6. 在凝胶上选择相邻的加样孔。用10ml的吸液头分别将管中的样品加入凝胶的加样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入1.5-3ml DNA
11、分子量标准物）。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。7. 打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约30min。8. 当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。9. 把凝胶小心反扣放入盛有EB的搪瓷盒中。放置约10分钟后，取出用自来冲洗两次。10. 清理垃圾。染有EB的凝胶要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。11. 撰写实验
12、报告。【思考】（1） 泳道中的质粒DNA有几条带？为什么？（2） 影响本实验结果的因素有哪些？实验三 感受态细胞的制备和转化【目的】了解和掌握感受态细胞制备与转化的原理和操作步骤，获得转化有质粒pGEX-6p的转化菌株。【原理】转化作用是在一定条件下，一种特定的DNA分子（供体或称转化因子）转入到一定的细菌体内（受体菌），使其发生遗传形状改变的过程。在正常生长条件下，少数细菌可发生转化作用，但大多数细菌并不发生转化，只有在一定条件作用下（如用Ca+处理细菌细胞或电刺激），细菌呈现感受状态后，外源DNA才能转化进入受菌体内。因此，若想将外源DNA分子转化进入一定的受菌体内，通常需将受体菌先制备成
13、易感受状态。感受态通常指的是细菌具备吸收转化因子的一种生理状态。产生感受态细胞的理论机制目前除有一些假说外，并无统一的结论。一般说来，细菌细胞在对数生长的早中期，经处理后，有一定的转化能力，但在它们进入静止生长期以后，就逐渐丧失。因此进行细菌细胞转化时，掌握合适的细菌培养时机是很重要的。本实验所用的供体DNA分子为一个重组质粒，含有编码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶（GST）的基因。因此可在受体菌体内将表达出GST。实验中所用的受体菌为大肠杆菌BL21（DE3）选择此菌株是因为可用乳糖替代IPTG作为目的基因表达的诱导剂，使实验的进行更为经济。【器材】超净工作台HBY恒温摇床台式高速离心机恒温培养
14、箱721分光光度计高压灭菌锅灭菌Eppendorf管 试管 微量移液枪 培养皿灭菌离心管 移液管 涂布棒【试剂】LB液体培养基： 1000ml含蛋白 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g，溶于950ml双蒸水中，用NaOH调pH至7.0，然后定容为1000ml。15磅20分钟高压灭菌。需加抗菌素时，冷却至50以下，加入相应浓度的抗菌素。LB固体培养基：向LB液体培养基中加入2.0%的琼脂粉，15磅20分钟高压灭菌，然后加入适量抗菌素，向每个平板中倒入15-20mlLB固体培养基，凝固后倒置，4保存。转化试剂：CaCl2溶液（lM）：取54g CaCl26H2O溶于20ml无菌水中，15磅20分钟灭菌后，分装成小份于4保存。菌株与质粒：大肠杆菌BL21（DE3）hsdSgal（cits857indlsam7ni5lacuv5-T7 genel）。质粒pGEX-6p。【操作步骤和方法】1. 大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞的制备将一BL21（DE3）单菌落种于20mlLB液体培养基中，37振荡培养过夜。取5ml上述菌液转种于50ml培养液中，37 振荡培养约1小时，至0.D600值为0.4-0.5左右，停止培养，菌悬液于冰上冷却10分钟后，转至40ml灭菌离心管中，在4，4000rpm离心10分钟，弃上清，菌体悬于10ml预冷的无菌的0.1M CaCl2溶液中，冰浴15分
