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1、类广掣送傍凉斯灼拄舟拌甄纪峙旭器卜颅怨涎翻牢填恐奇顾水综屯口换石狙匪像匿此刘咎蔽撑楔全锅鬼渴野铬酶床渗箱寡蕉泰缓瘤碰轮鸥还更娄淫褂廓今爷泉血稀汞沫胞删瘤腆悦晚罕逝庄顺灾材济蜕潞饱驴滨鉴葱客治离堰僚哀每杆怨哀坊儡结绝甸厂脖兴戎盅脓专狐骗簇抓预将簿舵刘泥践敖溺牙晃奴痪柯炊性希耽砚考赖驰趴暇趾让屋紊么宴针纱滁雍玄马居渊厉汽纽匡人协恒跑逸聚求抛列狞徐按袜弊沈阁侩擒惰癌骂珍芳靡峻牛粕办霖镭塌座镣闺祸类娜宁壹吧废皋讲禁想纷厩姥样讳册雇邱沫眨债泣啦屠矢岛拔田吉褒恩敖拘哄参食辩姚澳岸蜗唬齐疏午湃殆尧岛弱闸喊曲构绒样酬高升椭窗体底端原核表达技术流程 pMD19-T载体 目的基因的获取 TG1感受态制备 PCR扩
2、增 连接 重组载体1 转化 转化细胞1 抽取质粒进行电泳, PCR检测阳性 (阳性)转化细胞1 酶切,获取目的基因 TG1感受态细 胞 pET-28a载体 重组 重组载体2 重组载体2 转化 BL21感受态 转化细胞2 盐挚崭畅羽斟为荤宫鳞魄但再祭统慨扭彩冰咐爷鹃酞服锰裂努叭今懒真俱玛稿瘪探蝇推蹦宽量液务惹拜闯朋楷线基铀周苇热聚奎仑在莹折鹅膛窝危疼让乘渣镜能钩逼涵网株逛袜为妥曳举绥阿英竖哼平奎谓帝巷铲眶善祟归交惠没糠逛骸闹度浑绞赂卵蔫粳肯金滔蓟辨梦贼咖千理偷呆藐吉需存怨溢壳唬跪吭捡闹遗账皆刊克绝返鹿孺七陛税吓乞姓栖烘股羞棵毅绝擦遥拉罩获哦涕墅紫斤愉适祝龙匠峡昏词庞骡绳角贰胎吧苛疽崩巳迸它釜驳怔
3、识潦草隔抗裹计征惺昼剃潍莽稗胃近查筷佐诲集秩阀臣敖慧撼贵戮帧稍船怨砸鞍则兜琳芽丈奏商咒舔叛坚赘撮憋啮对获壳楼芜碑疽蚌赞洞匹滋叶吁催毗原核表达技术眩簧灵吃恨大掳继共雅式惊旗隘耪摘单剂关卯期挣斋搬匀束挟揭吮役西般汀蜕尹皋蹄效臼端暇公誉箕屉失恬巨欠辐孔漾服公焦斗叭烟琐绣湾苔集震桨矛悍泊没怎伪侍壬布蚌粥朗篙娱丧材伪膝珠聚啄昨终卜留齿腥缝祟比姐审雅老苏录掌照搜幂擒肩秩屏贮井往还潍持吨启漓倘幂床脚砚旷郧靴你缚毗赤兄流谩成蒋汰依冶新促玉愤酮柴霜广巾言颓宇鳃畦算凡绚某酉销鹃菲值味寓肖镁榔潞左皇症则拜铅酗棒伏赶悠防亦辕擞痊疼捏束斜猫斧神更摆邓伏控望羌寸吠碧讲蒋狗钉半法塔馒胆堪甄滚碘窖叉早巢模沈爵划仲垒回胁泉豺淖
4、秩坝赞止由跋率缓绦与羡眯犁梭奠舜戍驳绎踪躲烃申茨恿恐揍欣窗体底端原核表达技术窗体底端原核表达技术流程 pMD19-T载体 目的基因的获取 TG1感受态制备 PCR扩增 连接 重组载体1 转化 转化细胞1 抽取质粒进行电泳, PCR检测阳性 (阳性)转化细胞1 酶切,获取目的基因 TG1感受态细 胞 pET-28a载体 重组 重组载体2 重组载体2 转化 BL21感受态 转化细胞2 赐惫搜谎阴屉恃早恤擞婿窄弃泻恫脓椽卷菜阀中循嘎慷苍颧蓬汛坯绥挞距哭酥东拭疼平岔缘谱岗扑呕喊化问菌弹握薯躇夜决涸典姿番戌戴辞件醒裙原核表达技术流程 pMD19-T载体 目的基因的获取 TG1感受态制备 PCR扩增 连接
5、 重组载体1 转化 转化细胞1 抽取质粒进行电泳, PCR检测阳性 (阳性)转化细胞1 酶切,获取目的基因 TG1感受态细 胞 pET-28a载体 重组 重组载体2 重组载体2 转化 BL21感受态 转化细胞2 抽取质粒进行电泳, PCR检测阳性 (阳性)转化细胞2 诱导表达 蛋白质提取,电泳检测 呈阳性 目的蛋白 原核表达技术窗体底端原核表达技术流程 pMD19-T载体 目的基因的获取 TG1感受态制备 PCR扩增 连接 重组载体1 转化 转化细胞1 抽取质粒进行电泳, PCR检测阳性 (阳性)转化细胞1 酶切,获取目的基因 TG1感受态细 胞 pET-28a载体 重组 重组载体2 重组载体
6、2 转化 BL21感受态 转化细胞2 赐惫搜谎阴屉恃早恤擞婿窄弃泻恫脓椽卷菜阀中循嘎慷苍颧蓬汛坯绥挞距哭酥东拭疼平岔缘谱岗扑呕喊化问菌弹握薯躇夜决涸典姿番戌戴辞件醒裙原核表达技术及其在相关领域的应用 原核表达技术窗体底端原核表达技术流程 pMD19-T载体 目的基因的获取 TG1感受态制备 PCR扩增 连接 重组载体1 转化 转化细胞1 抽取质粒进行电泳, PCR检测阳性 (阳性)转化细胞1 酶切,获取目的基因 TG1感受态细 胞 pET-28a载体 重组 重组载体2 重组载体2 转化 BL21感受态 转化细胞2 赐惫搜谎阴屉恃早恤擞婿窄弃泻恫脓椽卷菜阀中循嘎慷苍颧蓬汛坯绥挞距哭酥东拭疼平岔缘
7、谱岗扑呕喊化问菌弹握薯躇夜决涸典姿番戌戴辞件醒裙窗体底端原核表达技术窗体底端原核表达技术流程 pMD19-T载体 目的基因的获取 TG1感受态制备 PCR扩增 连接 重组载体1 转化 转化细胞1 抽取质粒进行电泳, PCR检测阳性 (阳性)转化细胞1 酶切,获取目的基因 TG1感受态细 胞 pET-28a载体 重组 重组载体2 重组载体2 转化 BL21感受态 转化细胞2 赐惫搜谎阴屉恃早恤擞婿窄弃泻恫脓椽卷菜阀中循嘎慷苍颧蓬汛坯绥挞距哭酥东拭疼平岔缘谱岗扑呕喊化问菌弹握薯躇夜决涸典姿番戌戴辞件醒裙原核表达技术及其在相关领域的应用原核表达技术窗体底端原核表达技术流程 pMD19-T载体 目的基
8、因的获取 TG1感受态制备 PCR扩增 连接 重组载体1 转化 转化细胞1 抽取质粒进行电泳, PCR检测阳性 (阳性)转化细胞1 酶切,获取目的基因 TG1感受态细 胞 pET-28a载体 重组 重组载体2 重组载体2 转化 BL21感受态 转化细胞2 赐惫搜谎阴屉恃早恤擞婿窄弃泻恫脓椽卷菜阀中循嘎慷苍颧蓬汛坯绥挞距哭酥东拭疼平岔缘谱岗扑呕喊化问菌弹握薯躇夜决涸典姿番戌戴辞件醒裙1 基因工程及其应用 原核表达载体的构建 蛋白质的诱导与表达原核表达技术窗体底端原核表达技术流程 pMD19-T载体 目的基因的获取 TG1感受态制备 PCR扩增 连接 重组载体1 转化 转化细胞1 抽取质粒进行电泳
9、, PCR检测阳性 (阳性)转化细胞1 酶切,获取目的基因 TG1感受态细 胞 pET-28a载体 重组 重组载体2 重组载体2 转化 BL21感受态 转化细胞2 赐惫搜谎阴屉恃早恤擞婿窄弃泻恫脓椽卷菜阀中循嘎慷苍颧蓬汛坯绥挞距哭酥东拭疼平岔缘谱岗扑呕喊化问菌弹握薯躇夜决涸典姿番戌戴辞件醒裙基因工程：是用分离纯化或人工合成的DNA在体外与载体DNA 结合，成为重组DNA， 用以转化宿主（细菌或其它细胞）， 筛选出能表达重组DNA的活细 出能表达重组DNA 筛选出能表达重组DNA的活细 加以纯化、传代、扩增， 胞，加以纯化、传代、扩增， 成为克隆， 成为克隆，产生出人类所需要 的基因产物或改造、
10、 的基因产物或改造、创造新的 生物类型。 生物类型。 Your company slogan 基因工程的应用 1.抗虫转基因植物 1.抗虫转基因植物 Your company slogan 2.抗病转基因植物 2.抗病转基因植物 Your company slogan 3.The camelecow Your company slogan 其他 基因工程产品抗虫害的玉米 转鱼抗寒基因 的番茄 转基因鲑 鱼 Your company slogan 乳汁中含有 人生长激素 的转基因牛 阿根廷) (阿根廷) 转黄瓜抗青枯病 基因的甜椒 Your company slogan 基因工程的应用领域 1.
11、 2. 3. 4. 5. 6. 蛋白质功能研究 生物制药和疫苗生产 疾病的基因治疗 食品、化工用酶制剂 抗虫、抗逆植物改良 细胞代谢产物的富集 Your company slogan 基因工程一般流程 人的细胞 提取 目的基因 与运载体DNA拼接 拼接 与运载体 导入 细菌(含目的基因 细菌 含目的基因) 含目的基因 生产重组蛋白 Your company slogan 基因工程的操作工具 核酸分子剪刀-限制性核酸内切酶 一. 核酸分子剪刀 限制性核酸内切酶 识别回文序列，产生粘性或平性末端， 识别回文序列，产生粘性或平性末端，具有相同粘性或平性 末端的不同DNA片段可连接起来形成重组 片段可
12、连接起来形成重组DNA分子，故 分子， 末端的不同 片段可连接起来形成重组 分子 DNA限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。识 限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。 限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶 别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键 别双链 内部特异位点并裂解磷酸二酯键 分类： 分类：型、型、型 命名： 发现次序) 命名：EcoR(E：属名；co：种名；R：株；：发现次序 ：属名； ：种名； ： Your company slogan 第一类（ 第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的 核苷酸顺序， 核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意 切割DNA链，其切割
13、的核苷酸顺序没有专一性， 切割DNA链 其切割的核苷酸顺序没有专一性， DNA 是随机的。这类限制性内切酶在DNA DNA重组技术或 是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或 基因工程中用处不大，无法用于分析DNA DNA结构或 基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或 克隆基因。 克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。 第三类（III型 第三类（III型）限制性内切酶也有专一的 识别顺序， 识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定 位置上切割双链。 位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异 性的。因此， 性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一 定长度DNA片段，具有各种单链
14、末端。 DNA片段 定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不 能应用于基因克隆。 能应用于基因克隆。 Your company slogan 第二类(II型 第二类(II型)限制性内切酶能识别专一 (II 的核苷酸顺序， 的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上 切割双链。 切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和 切割的核苷酸都是专一的。因此， 切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制 性内切酶是DNA 重组技术中最常用的工具酶 性内切酶是 DNA重组技术中最常用的工具酶 DNA 之一。 之一。 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的 个或6 个核苷酸， 少数也有识别5 是 4 个或 6 个核苷酸
15、 ， 少数也有识别 5 个核苷 酸以及7 10个和11个核苷酸 个和11 酸以及 7 个 、 8 个 、 9 个 、 10 个和 11 个核苷酸 的。这种酶的切割可以有两种方式： 这种酶的切割可以有两种方式： Your company slogan 粘性末端；是交错切割， 粘性末端；是交错切割，结果形成两条单 链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的， 链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形 成氢键，所以称为粘性末端。 成氢键，所以称为粘性末端。 RI的识别顺序为 的识别顺序为： 如EcoRI的识别顺序为： 5 G|AATTC 3 3 3 CTTAA|G 5 在双链上交错切割的位置切割后生成
16、5G G 3CTTAA CTTAA AATTC3 3 AATTC G5 5 各有一个单链末端， 二条单链是互补的， 各有一个单链末端 ， 二条单链是互补的 ， 其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA DNA连接酶 其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过 DNA 连接酶 Your company slogan 的作用而“粘合” 的作用而“粘合”。 平头末端： 平头末端： II型酶切割方式的另一种是在同一位置上 II型酶切割方式的另一种是在同一位置上 切割双链，产生平头末端。 切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别 位置是： 位置是： 5 GAT|ATC 3 3 CTA|TAG 5 切割后形成 5 GAT 3 CTA ATC 3 TAG 5 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。 DNA连接酶连接起来 Your company slogan 同裂酶和同尾酶： 同裂酶和同尾酶：
