L-色氨酸混菌发酵工艺

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1、L-色氨酸混菌发酵工艺张震;熊海波; 徐庆阳期刊名称】食品与发酵工业年(卷),期】2019(045)014【总页数】7页(P115-121)【关键词】L-色氨酸;大肠杆菌TRTH;谷氨酸棒杆菌TQ2223;混菌发酵工艺;代谢副产物【作 者】 张震; 熊海波;徐庆阳【作者单位】 天津科技大学生物工程学院天津 300457;代谢控制发酵技术国家地 方联合工程实验室天津 300457;天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室天津 300457【正文语种】 中文混菌发酵是指利用两种或多种微生物的协同作用共同完成发酵过程的一种发酵技术 1。混菌发酵中不同菌种各自的代谢活动具有互补性，并且不会互相抑制生长， 表

2、现出互生关系。这种互补性质有时也能获得纯种培养难以达到的良好效果，例如 可提高产品产率、获得特殊代谢产物等2-3。目前，混菌发酵在食品发酵、废物 处理、酒精生产及环境改造等领域已有较多应用，其他方面的应用也在逐渐开展 4。L-色氨酸是8种必需氨基酸之一，又被称为第二必需氨基酸5。它能够调节人和 动物的新陈代谢和生理功能，改善人和动物的消化功能，并提高其免疫功能，对人 和动物的生长发育起着至关重要的作用6-7，因而被广泛用于饲料和医药行业。 近年来，随着色氨酸功能的进一步研究，开始在食品、农业与环境等领域推广应用， 市场发展前景十分广阔8。微生物直接发酵法是当前L-色氨酸生产的主流方法，该法以葡

3、萄糖等廉价原料为碳源，利用优良的色氨酸生产菌种来生产色氨酸，其中大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌应 用较多9-10。但是大肠杆菌在以葡萄糖作为原料生产色氨酸时，会有很大一部分 碳源流向乙酸、乳酸等代谢副产物。当副产物累积到一定浓度时，菌体生长受到严 重抑制，比生长速率迅速下降，从而导致产物合成速率降低，产量下降11-12， 影响产品质量，因此减少乙酸、乳酸等副产物的积累对发酵法生产L-色氨酸具有 重要意义。谷氨酸棒杆菌能利用乙酸、乳酸等有机酸作为其代谢碳源进行生长13 且不会对大肠杆菌产生抑制14。本研究以无拮抗反应的2株色氨酸生产菌大肠杆 菌(Escherichia coli)TRTH 和谷氨酸棒杆菌

4、(Corynebacterium glutamicum) TQ2223作为混菌发酵研究对象，构建了以大肠杆菌为主、谷氨酸棒杆菌为辅的L-色氨酸混菌发酵工艺，并采用单因素试验对混菌发酵的最佳生产条件进行优化， 有效地降低了发酵过程中乙酸、乳酸等代谢副产物的积累，提高了 L-色氨酸的产 量及糖酸转化率，为发酵法高效生产L-色氨酸提供了新方案。1 材料与方法1.1 菌种L-色氨酸工程菌大肠杆菌TRTH(trpEDCBA+TetR)，L-色氨酸工程菌谷氨酸棒杆菌TQ2223(Phe-+Tyr-)，由天津科技大学代谢工程研究室提供。1.2.1 斜面培养基大肠杆菌TRTH(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，

5、牛肉膏10，KH2PO4 1， MgSO47H2O 0.5,琼脂粉20,四环素0.05。谷氨酸棒杆菌TQ2223(g/L):蛋白胨10,酵母粉5，牛肉膏10, NaCI 2.5，玉米 浆粉 8，KH2PO4 1，MgSO47H2O 0.5,琼脂粉 20。1.2.2 种子培养基大肠杆菌TRTH :葡萄糖10 g/L，酵母粉4 g/L，柠檬酸0.5 g/L , (NH4)2SO4 1 g/L , KH2PO4 1 g/L , VB1 1 mg/L , VH 0.3 mg/L , MgSO 4 7H2O 1.5 g/L, FeSO47H2O 2.8 mg/L,微量元素混合溶液2 mL/L。谷氨酸棒杆

6、菌TQ2223 :葡萄糖20 g/L，酵母粉4 g/L ,豆饼水解液20 mL/L , (NH4)2SO4 5 g/L,KH2PO4 1 g/L,VB1 0.3 mg/L,VH 0.2 mg/L, MgSO47H2O 1 g/L,FeSO47H2O 10 mg/L, Phe 0.1 g/L , Tyr 0.1 g/L。1.2.3 发酵培养基混菌发酵和对照发酵培养基：葡萄糖15 g/L，酵母粉6 g/L，柠檬酸2 g/L , (NH4)2SO4 4 g/L , KH2PO4 5 g/L ,MgSO 47H2O 2 g/L, FeSO 4 7H2O 75 mg/L,VB1 5 mg/L,VH 0.

7、2 mg/L ,微量元素混合溶液4 mL/L。1.3 仪器与设备LDZH-100KBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；5 L不锈钢机械搅拌 发酵罐，上海保兴生物设备工程有限公司；30 L不锈钢机械搅拌发酵罐，上海保 兴生物设备工程有限公司；BST-AH智能电加热蒸汽发生器，湖北贝思特智能科技 有限公司；SBA-40E生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所；TU 1810紫外 可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；LC20AT高效液相色谱仪，日 本岛津公司；A300氨基酸分析仪，德国安米诺西斯公司。1.4 培养方法1.4.1 菌种活化取甘油管中菌种接种于斜面培养基中，传代活化2次

8、。大肠杆菌TRTH :37 C恒 温倒置培养，每代培养12 h ；谷氨酸棒杆菌TQ2223 :32 C恒温倒置培养，每代 培养24 h。1.4.2 摇瓶培养种子培养：从活化好的斜面上刮取1环菌体到装有30 mL种子培养基的三角瓶(500 mL)中，9 层纱布封口。大肠杆菌 TRTH :37 C, 220 r/min 培养 810 h ; 谷氨酸棒杆菌 TQ2223 :32 C, 200 r/min 培养 12 14 h。发酵培养：将培养好的种子液按一定接种量接种到装有30 mL发酵培养基的500 mL容量瓶中，9层纱布封口，摇床转速220 r/min，培养26-28 h。过程中补加 氨水维持p

9、H，补加600 g/L的葡萄糖溶液维持碳源供给。1.4.3 5 L罐种子培养利用5 L发酵罐进行种子培养，初始发酵液体积定容至3 L。初始通气量为2L/min，初始搅拌转速为200 r/min，通过自动流加25%的氨水控制发酵液pH值 在7.0 -7.2 ,TRTH 37 C培养，TQ2223 32 C培养，通过搅拌和通风控制溶氧， TRTH维持在25% - 30% , TQ2223维持在15% - 30%，以消泡剂消泡。1.4.4 30 L罐发酵培养在最优条件下利用30 L发酵罐进行混菌发酵培养，初始发酵液体积定容至15 L , 通过自动流加25%的氨水控制培养基pH，通过搅拌和通风控制溶氧

10、在25%- 40%，通过流加800 g/L的葡萄糖溶液维持发酵，维持罐内糖质量浓度4 g/L, 发酵过程中，以泡敌消泡，每隔2 h测样、记录数据。1.5 试验方法1.5.1 菌株拮抗试验利用平板扩散对峙法检测大肠杆菌TRTH和谷氨酸棒杆菌TQ2223菌株间的拮抗 反应，具体步骤如下：将2种菌分别在斜面培养基中培养24 h之后用无菌水洗脱， 制备菌悬液，取2%接种到发酵培养基中,32或37 C振荡培养24 h。培养结束 后，分别取200 pL发酵液涂布在不同的发酵培养基平板上，并打孔。随后将2株 菌的发酵液离心取上清(13 000 r/min、2 min)，并将1种菌株的上清液100 pL 滴加

11、在涂布有另一种菌株的平板孔中，以无菌水做阴性对照，设置 3 组平行试验， 置32或37 C恒温箱中培养24 h后观察有无抑菌圈形成。1.5.2 单因素试验 在摇瓶水平上进行单因素实验，对混菌发酵生产色氨酸的最适条件进行初步探究。固定大肠杆菌TRTH接种量(10%)、培养体积(30 mL/500 mL)、摇床转速(220 r/min)及培养时间(26-28 h)，分别考察2种菌的接种间隔时间、谷氨酸棒杆菌 TQ2223接种量、pH及培养温度对OD600值、L-色氨酸产量及乙酸积累量的影 响(表1)。1.5.3 混菌发酵工艺流程本工艺采用2个5L发酵罐(罐A、罐B)和1个30L发酵罐(罐C) ,

12、3罐1组进行双菌混合发酵。罐A用于大肠杆菌TRTH种子培养，罐B用于谷氨酸棒杆菌TQ2223种子培养，罐C用于混菌发酵培养。罐A、罐B同时开始种子培养，罐A内大肠杆菌TRTH种子培养好后先接入已消 毒的罐C中，开始发酵培养，发酵至14 h时，再将培养好的罐B内谷氨酸棒杆菌 TQ2223种子接入罐C中，实现混菌发酵培养。具体操作要点如下：表1培养条件单因素试验因素与水平Table 1 Factors and levels of singlefactor experiment for culture conditions 水平试验因素 TQ2223 接种量/%接种 间隔时间/hpH培养温度/ C1

13、086.63421.25106.83532.5127.03645147.23757.5167.438610187.6- 注：“-”表示无该因素水平。(1)首先将2株菌种扩培到相应的5 L种子罐中进行种子培养，种子培养基均定容至3 L,大肠杆菌TRTH 37 C培养，谷氨酸棒杆菌TQ2223于32 C培养，在此 期间将罐C空消(121 OC, 20 min)，之后加入发酵培养基并加水定容至13.5 L后 实消(115 C，15 min)。待罐A内大肠杆菌TRTH种子液菌体浓度OD600达到10 12时，利用压差 将其按10%接种量(1.5 L)经无菌管道接入实消好的罐C中，发酵培养基最终定容 至

14、15 L,维持36 C、pH 7.0发酵培养，同时，罐B内谷氨酸棒杆菌TQ2223继 续维持种子培养。(3)罐C发酵开始14 h后，先将发酵液放出1.1 L，再将罐B内培养好的谷氨酸棒 杆菌TQ2223种子液利用压差按7.5%接种量(J.1 L)经无菌管道接入罐C中，继 续维持36 C、pH 7.0发酵培养。混菌发酵工艺流程如图1所示。图 1 混菌发酵工艺流程示意图 Fig.1 Schematic diagram of mixed bacteria fermentation process1.6 检测方法1.6.1 pH值测定采用Hamilton pH电极在线检测，精密试纸(pH 6.4 -

15、8.0)辅助检测。1.6.2 菌体浓度测定见参考文献15。1.6.3 L-色氨酸含量测定见参考文献16。1.6.4 有机酸副产物含量测定采用高效液相色谱法检测有机酸含量。Aminex HPX-87H色谱柱(300 mmx7.8 mm)，流动相5 mmol/L H2SO4，柱温30 C,流速0.5 mL/min，紫外检测波 长215 nm。1.6.5 氨基酸副产物含量测定采用A300氨基酸分析仪进行测定。1.7 分析方法糖酸转化率根据公式（1）计算： 糖酸转化率/%=（1）式中：发酵液中L-色氨酸质量浓度，g/L ；发酵液总体积，L;总耗糖量，g。所有试验数据取3次实验的平均值。单因素方差分析后Dunnet t检验来确定数据 差异的显著性（PvO.O5）。2 结果与分析2.1 菌种拮抗试验结果及共生体系的构建平板扩散对峙试验结果表明，大肠杆菌TRTH与谷氨酸棒杆菌TQ2223无拮抗反 应（无抑菌圈形成），可以进行混菌发酵（图2）。大肠杆菌TRTH是利用基因工程定向改造所得到的L-色氨酸高产菌株，拥有极佳 的L-色氨酸生产能力，30 L小试发酵34 h，产酸可达45 g/L以上17，但同时 也伴随有乙酸、乳酸等副产物生成，副产物的大量积累会给发酵带来严重的不利影 响。而谷氨酸棒杆菌TQ2223虽然L-色氨酸生产能力较弱，同等规模发酵72 h , 产酸只有10 g/L左右8，