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1、第8章 分子发光分析法81教学建议 一、从光谱定性分析和定量分析的依据和方法入手，在了解分子发光分析特点的基础上，介绍分子荧光与磷光光谱分析法的基本原理、仪器结构组成、常规测定方法及应用。二、在比较分子荧光与磷光光谱分析法的基础上，介绍化学发光分析方法的基本原理及分析特点与应用。 82主要概念一、教学要求：（一）、掌握分子荧光与磷光光谱分析方法的基本原理； （二）、掌握荧光与磷光分析仪器的结构组成、常规测定方法及应用；（三）、掌握化学发光法的基本原理及应用；二、内容要点精讲第一节 荧光分析法一、概述 分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。荧光分析的特
2、点：灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.10.001mg/mL之间。可见比UV-Vis的灵敏度高得多。 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。二、基本原理1、分子荧光的产生处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。单重态与三重态的区
3、别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s;而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-41s以上(通常用S和T分别表示单重态和三重态)。处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态。辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫( VR)、内部转移(IR)、系间窜跃(IX)及外部转移(EC)等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。2、去活化过程(Deactivatio
4、n) 处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态。这些过程包括：(1)振动弛豫(Vibrational Relaxation, VR)在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。(2)内转化(Internal Conversion，IC ) 对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。(3)荧光发射处于第一激发单重态中的电子跃 迁至基态各振动能级时，将得到最大
5、波长为3的荧光。注意：基态中也有振动驰豫跃迁。很明显，3的波长较激发波长1或2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为3的荧光。荧光的产生在10-7-10-9s内完成。三、荧光与有机化合物的结构1、跃迁类型对于大多数荧光物质，首先经历pp*，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生p*p跃迁而得到荧光。p*p跃迁常能发出较强的荧光(较大的量子产率)。这是由于pp*跃迁具有较大的摩尔吸光系数(一般比np*大100-1000倍)。其次，pp*跃迁的寿命约为10-710-9s，比np*跃迁的寿命10-510-7s要短。在各种跃迁过程的竞争中，它是有利于发射荧光的。此外，在pp*
6、跃迁过程中，通过系间窜跃至三重态的速率常数也较小(S1T1能级差较大)，这也有利于荧光的发射。总之，pp*跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。2、共轭效应容易实现pp*激发 的芳香族化合物容易发生荧光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少(仅少数高度共轭体系化合物除外)。此外，增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大。例如：在多烯结构中，Ph(CH=CH)3 Ph和Ph(CH=CH)2 Ph在苯中的荧光效率分别为0.68和0.28。共轭效应使荧光增强的原因 ：增大了摩尔吸光系数3、刚性平面结构多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互
7、作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。4、取代基效应芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。给电子基团，如-OH、-OR、-CN、-NH2、 -NR2等，使荧光增强。因为产生了p-p共轭作用，增强了p电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。吸电子基团，如-COOH、-NO、-C=O、卤素等，会减弱甚至会猝灭荧光。卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。这可能是由所谓“重原子效应”使系间窜跃速率增加所致。在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的概率。 取代基的空间障碍对荧光也有影响。 立体
8、异构现象对荧光强度有显著的影响。四、金属螯合物的荧光除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。但是，在某些情况下，金属螯合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属元素分析。1、螯合物中配位体的发光不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。2、螯合物中金属离子的特征荧光这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的p*p跃迁激发，接着配位体把能量
9、转给金属离子，导致dd*跃迁和ff*跃迁，最终发射的是dd*跃迁和ff*跃迁光谱。五、影响荧光强度的因素1、溶剂对荧光强度的影响增大溶剂的极性，pp*跃迁的能量减小，而导致荧光增强，荧光峰红移。但也有相反的情况，例如，苯胺、萘磺酸类化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇中，随着醇的极性增大，荧光强度减小，荧光峰蓝移。因此荧光光谱的位置和强度与溶剂极性之间的关系，应根据荧光物质与溶剂的不同而异。如果溶剂和荧光物质形成了化合物，或溶剂使荧光物质的状态改变，则荧光峰位和强度都会发生较大的变化。2、温度对荧光强度的影响温度上升使荧光强度下降。其中一个原因是分子的内部能量转化作用。当激发分子接受额外热能时
10、，有可能使激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量。另一个原因是碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。3、溶液pH值对荧光强度的影响带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的pH有关。具有酸性或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构 可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，因pH值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。4、顺磁性物质的存在,使激发单重态的体系间窜越速率增大,因而会使荧光效率降低。六、溶液荧光猝灭荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。导致荧光猝灭
11、的主要类型：(1)碰撞猝灭碰撞猝灭是指处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态，产生猝灭作用。(2)静态猝灭(组成化合物的猝灭)由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收光谱的改变。(3)转入三重态的猝灭分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重态的荧光物质分子，使荧光猝灭。(4)发生电子转
12、移反应的猝灭某些猝灭剂分子与荧光物质分子相互作用时，发生了电子转移反应，因而引起荧光猝灭。(5)荧光物质的自猝灭在浓度较高的荧光物质溶液中，单重激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭。有些荧光物质分子在溶液浓度较高时会形成二聚体或多聚体，使它们的吸收光谱发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。七、胶束增敏荧光加入临界浓度以上的表面活性剂，如十二烷基硫酸钠。1、溶液的荧光强度(1)荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率j 。 If =j Ia式中j为荧光量子效率，又根据Beer定律Ia = I0 - It = I0(1- e -A)I
13、0和It分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得If =j I0(1- 10 -A) =j I0(1- e -2.3A)整理得： If =2.3j I0kbc当入射光强度I0和I一定时，上式为：If = K c即荧光强度与荧光物质的浓度成正比，但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当A0.05时才成立。对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。2、荧光激发光谱与发射光谱任何荧(磷)光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧(磷)光定性分析的基础。(1)激发光谱改变激发波长，测量在最强荧(磷)光发射波长处的强度变化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱。激发光
14、谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激发过程。激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最适宜的激发波长。(2)发射光谱发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的激发波长辐照荧光物质，产生不同波长和强度的荧光，以荧光强度对其波长作图可得荧光发射光谱。由于不同物质具有不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。(3)激发光谱与发射光谱的关系a 波长比较与激发(或吸收)波长相比，荧光发射波长更长，即产生所谓Stokes位移。(振动弛豫失活所致)b 形状比较荧光光谱形状与激发波长无关。尽管分子受激可到达不同能级的激发态，但由于去活化(内
15、转换和振动弛豫)到第一电子激发态的速率或几率很大，好像是分子受激只到达第一激发态一样。换句话说，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。七、荧光仪器(光源与检测器处于相互垂直的位置)1、光源： 氙灯、高压汞灯、激光；2、样品池：石英(低荧光材料)；3、两个单色器：选择激发光单色器,分离荧光单色器；4、检测器：光电倍增管。八、荧光分析法的应用荧光测定必须在极稀的溶液中才可用于定量测定。 标准曲线法测定荧光物质的含量九、荧光分析法的应用1、无机化合物的分析大多数无机离子与溶剂之间的相互作用很强,其激发态多以非辐射跃迁方式返回基态,发荧光者甚少。然而很多无机离子可以与一些有机化合物形成有荧光的络合物,利用这一性质可对其进行荧光测定。能够同金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物,通常含有两个或两个以上的官能团,能与金属离子形成五元环或六元环的螯合物。由于螯合物的生成,分子的刚性平面结构增大,使原来不发荧光或荧光较弱的化合物转变为强荧光化合物。2、有机化合物的分析脂肪族有机化合物的分子结构较为简单,本身能发生荧光的很少,一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光
