巨噬细胞培养

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1、巨噬细胞培养 巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫 学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁 殖细胞群，在条件适宜下可生活23周，多用做原代培养，难以长期生存。 巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如 P331、S774A.1、RAW309Cr.l 等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难 以建株。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实 用，其法如下：1. 实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml （勿注入肠内）。2. 引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70%

2、酒精中35秒。 3置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露 出腹膜，但勿伤及腹膜壁。4. 再用70%酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同 时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。5用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸 取入针管内。6. 小心拔出针头，把液体注入离心管中，1000g 4C离心10分钟，去上清， 加10 ml Eagle培养基。7. 计数细胞，每只小鼠可产生2030X 105细胞，其中90%为巨噬细胞。8. 为获取3X105个帖附细胞/平方厘米，需接种2.5X106/ml。9. 为纯化培养细胞

3、，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle 液冲洗12次后，再加新Eagle培养液置37C CO2温箱中培养。小鼠腹腔巨噬细胞的制备1. 小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡3分钟，取出小鼠，置于无菌纸上，腹 面朝上；2. 用镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，撕开皮肤，完全暴露腹膜；3. 10ml注射器装上大号针头，注入6 ml Hanks液或PBS，用镊子提起腹膜， 向腹腔中注入Hanks液，针尖朝上，避开肠和脂肪，回抽腹腔液，不同方向 冲洗数次，吸出腹腔液；4细胞悬液离心200Xg10分钟，用Hanks液洗一次，用RPMI1640 5%小牛 血清悬起细胞，2X106细胞/ ml

4、 ；5. 细胞悬液置入培养瓶，37度培养2小时后，吸弃上清，用预热培养基洗二 次，留下贴壁细胞；6含10mMEDTA的PBS加入培养瓶，覆盖细胞，37度孵育20分钟，用吸管 用力吹打下细胞，或用橡皮擦帚轻轻刮下细胞，即为腹腔巨噬细胞，纯度一般大于90%，每只小鼠平均可得2X106腹腔巨噬细胞。注:1. 雌性小鼠6-8周最适用。雄性小鼠肠壁脂肪多。不利于腹腔液收集；2. 在冲洗过程中应小心，以免刺破血管或肠壁，血液流入腹腔液；3. 吸出的腹腔液应洗后再贴壁，否则有血浆膜形成，影响贴壁；4. 贴壁巨噬细胞分离有较多方法，如利多卡因孵育等，但大多不够理想，故 细胞分离后应用台盼兰染色检测活力；5.

5、橡皮擦帚可自制，用自行车气门芯上的橡皮管套在预先折弯的滴管尖头 上，灭菌后使用，较为实用；6. 炎性巨噬细胞的制备可用3%的脱水硫羟乙酸培养基2ml，注入小鼠腹腔， 4天后同法由集腹腔细胞，每只小鼠腹腔细胞产量可以增加到3X107细胞左 右。需指出的是炎性巨噬细胞的功能活性与正常腹腔巨噬细胞有很大差异。巨噬细胞的纯化1）用帖壁法纯化巨噬细胞1. 用含20%40%小牛血清的RPMI-1640培养液将巨噬细胞配成2X1064X1 06/ml的浓度。以每平方厘米2X1054X105个巨噬细胞的密度将细胞悬液接种 到玻璃培养皿（瓶）或塑料培养皿（瓶）中37C 5% CO的饱和水汽二氧化碳2 培养箱中培

6、养1小时或24小时。1小时培养节省时间但会丢失一些粘附力弱的 巨噬细胞，而24小时可以得到较多的巨噬细胞。 20%40%的小牛血清可以减 少B淋巴细胞的粘附。2. 摇晃培养皿（瓶），悬浮未粘附细胞，吸出细胞悬液。用预温的Hanks液洗 涤细胞34次。悬浮细胞可重复粘附，得到更多巨噬细胞。用适量含2.5mmol/ L EDTA的无钙镁Hanks液消化细胞37C 1530分钟。用吸管吹打分离细胞， 离心250Xg 10分钟，去上清液。3. 用预冷的Hanks液洗涤细胞34次，每次离心250Xg 10分钟，去上清液。 最后用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并 决

7、定细胞活力，将细胞配成所需的浓度。2）用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞1. 取15ml离心管，将制备好的各浓度密度梯度材料按下浓上淡的顺序 依次分层加在离心管中，每个浓度2ml。最后加上上述巨噬细胞悬液35ml （约 含2X1075X107细胞）。2. 4C中，水平离心1000Xg 30分钟，垂直取出离心管，小心吸出各交 界面的细胞。分别用预冷的含1%小牛血清RPMI-1640培养液洗涤各交界面细胞 2次，每次200Xg 10分钟。用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成 所需的浓度。Blasi等2研究鼠克隆巨噬细胞系对酵母相（Y相）及菌丝相（H相）白念 珠菌的应答时发现，巨噬细

8、胞能分辨 Y 相及 H 相菌并给予不同应答。对 Y 相菌仅 是吞噬作用而不引起巨噬细胞自身分泌功能的变化，而H相菌可作为刺激信号引 起巨噬细胞肿瘤坏死因子（TNF）分泌增加及溶菌酶分泌减少。尽管TNF不导致 H 相菌的死亡，但可通过自分泌及旁分泌的机制调节巨噬细胞及其它效应细胞的 抗白念珠菌活性。在非单一细胞系里，由于不同细胞类型间的配合，鼠脾巨噬细 胞体外在Y相白念珠菌的刺激下也应答而分泌TNF。Blasi P et al.Infect Immun,1992;60（3）:832-837 细胞培养过程中的注意事项及试剂配制一. 常用设备 准备室的设备： 单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤

9、箱、高压锅、储品柜（放置未消毒 物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器 （配置溶液室搅拌溶液）。培养室的设备： 液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80C）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的 设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、 CO2 孵箱（孵育培养物）、 水浴锅、三氧消毒杀菌机、4C冰箱（放置serum和培养用液）。二. 无菌操作 无菌室的灭菌：1. 定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等， 然后

10、用3%。来苏尔或者新洁尔灭或者0.5%过氧乙酸擦拭。2. CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3%。新洁尔灭擦拭，然后用75%酒精擦拭或者 0.5%过氧乙酸，再用紫外灯照射3. 实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟4. 实验后灭菌：用 75%酒精（3%新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的 载物台。实验人员的无菌准备：1. 肥皂洗手。2. 穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3. 用 75%酒精棉球擦净双手。无菌操作的演示：1凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒 精擦拭瓶子的外表面2. 靠近酒精灯火焰操作。3. 器皿使用前必须过火

11、灭菌4. 继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。5. 各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。6. 吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。三. 器械的清洗和消毒 玻璃器械洗消：（1）新的玻璃器皿的洗消：1. 自来水刷洗，除去灰尘。2. 烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入 5稀盐酸中 12 小时以除去脏物、 铅、砷等物。3. 刷洗、烘干：12 小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净 后用烤箱烘干。4泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水1000ml ）浸 泡 12 小时，然后从酸缸内捞出器皿

12、用自来水冲洗 15 次，最后蒸馏水冲洗 3-5 次和用双蒸水过3 次。5烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。6高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气 成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。7. 高压消毒后烘干（2）旧的玻璃器皿的洗消：1刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过 来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。2泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即 用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3 次。3烘干、包装：洗

13、干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消 毒储存及防止灰尘和再次被污染。4高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着 温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出 3-5分钟后，关闭安全阀，气压 表指数随之上升，当指针指向15 磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻 璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）5烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。 金属器械洗消： 金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用 75 酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒 内包装好在高压锅内 1

14、5磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。橡胶和塑料： 橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲 干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：1 针式滤器帽不能泡酸液，用NaOH泡6-12小时，或者煮沸20分钟，在包装之前 要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上（凹向上），然后将螺旋稍微拧松一些， 放入铝盒中在高压锅内 15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使 用时应该立即将螺旋旋紧。2. 胶塞烘干后用2%氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30 分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30 分钟，再用自来水，蒸馏水， 三蒸水洗

15、净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时(切记时间 不能过长)，自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸 馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。4. 胶头可用75酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。5. 塑料培养瓶，培养板，冻存管：6. 其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用 70酒精 浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。 也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用23周时间洗除残留的氧化乙烯。 用20000lOOOOOrad的r射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标 记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水 不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配 制：氯化钻(CoC12 6H2o)2g, 30%盐酸10ml，蒸馏水88ml。 I r-*-. r f注意事项：1. 严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高 压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安 全阀是否通畅，以防高压时爆炸。2. 安装滤膜时注意光面朝上：注意