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1、生物工程专业实验讲义(适用于生物工程专业)曹飞制药与生命科学学院二零零九年四月目 录实验一 发酵种子的制备1实验二 E.coli和 Pseudomonas dacunhae 2014发酵培养2实验三 高速冷冻离心机的使用方法.3实验四 固定化生物催化剂的制备4实验五 游离细胞与固定化细胞酶活比较5实验六 固定化生物催化剂的连续生产6实验七Asp的分离7实验八 Asp脱羧反应制备L-Ala6实验九 离子交换树脂分离L-Ala8一、实验原理与实验流程实验原理：实验流程：清洗发酵罐培养基配制灭菌接种微生物发酵离心湿菌体卡拉胶固定化细胞富马酸溶液配制转化脱色等电点结晶过程检测（菌体浓度、形态、pH）固
2、定化细胞与游离细胞酶活测定标准曲线绘制干燥L天冬氨酸培养基配制灭菌接种微生物发酵转化离心脱色离交分离L-丙氨酸浓缩重结晶L丙氨酸PS20147纸层析检测反应进程过程检测（菌体浓度、形态、pH）离子交换树脂预处理实验一 发酵种子的制备一、 目的要求了解实验室种子制备过程。二、 原理种子制备过程包括琼脂斜面、固体培养基扩大培养、摇瓶液体培养和种子罐培养等多级扩大培养。在实验室里，一般只进行到摇瓶液体培养获得发酵用种子。不同菌种其具体制备方法不同，下图是菌种子制备过程示意图。斜面沙土管冷干管液氮管实验室种子制备生产现场种子制备生产种子制备的一般流程菌种保藏二级斜面一级斜面 米孢子 母瓶 子瓶一级种子
3、罐 发酵罐二级种子罐 三级种子罐三、 试验及器材1 菌种：斜面低温保藏的大肠杆菌（E.coli）和Pseudomonas dacunhae 201472 培养基：E.coli种子培养基：牛肉膏 0.5% 、NaCl 0.5%、 蛋白胨 1%、 pH 7.67.8P.dacunhae 20147种子培养基：15g/L谷氨酸钠、蛋白胨8g/L 、玉米浆5.5 g/L , KH2PO4 0.5g/L ,MgSO4 0.1g/L 。3 器材：天平、灭菌锅、试管、三角瓶（500mL）四、 操作方法1 按种子培养基配方分别配制1000mL液体培养基，分装于三角瓶中，每瓶100mL，压力1Kg/cm2灭菌3
4、0mins，结束后取出。2 挑一环斜面低温保藏的E.coli和 P.dacunhae 20147接于各自的种子培养基中，37培养24hs，转速约150rpm。3 种子瓶摇好后，及时接种到发酵罐。也可以在冰箱中短时间保藏。五、 思考与讨论1. 实验室种子制备的原则是什么？2. 哪些参数对于实验室种子制备产生影响？实验二 E.coli和 Pseudomonas dacunhae 2014发酵培养一、 目的要求1 了解发酵罐的结构，掌握发酵罐的基本操作技术。2 了解发酵罐中微生物生长的生长特征。3 掌握实验室中微生物从斜面摇瓶发酵罐的无菌操作培养技术，对工业化微生物生产过程作出初步了解。4 掌握酶合
5、成代谢调控机制。5 掌握发酵工艺控制工艺。二、 原理一定数量的微生物，接种于合适的新鲜培养基中，在适宜的培养条件下，所表现出的群体生长特征可分为四个时期，即延迟期、对数期、稳定期和衰亡期。微生物在各个时期的生理特征各不相同。微生物的生长过程是其总的代谢活动的综合体现，每一种代谢途径均由一些特有的酶的反应组成，同时微生物代谢具有高度的调节作用，通过本实验了解酶合成的调节机制之一酶合成的诱导。三、 试剂及器材1 菌种：实验一液体培养24h的E.coli和 P.dacunhae 20147的实验室种子2 发酵培养基：E.coli发酵培养基: 玉米浆4%、富马酸1%、K2HPO40.5%、MgSO40
6、.25%、NaCl0.1%（用氨水溶解富马酸后再加入玉米浆和其他成分，用稀盐酸调节pH为7.5），消泡剂1-2mL，pH 7.5。 P.dacunhae 20147发酵培养基：20g/L谷氨酸钠、蛋白胨10 g/L 、玉米浆20 g/L , KH2PO4 0.5g/L ,MgSO4 0.1 g/L、消泡剂1-2mL，用氨水调pH 至7.0-7.2。121，灭菌20min。通气，冷却至37（E.coli）或30（P.dacunhae 20147）。4器材：发酵罐、灭菌锅、721分光光度计、超净工作台、台式高速离心机、离心管、移液管。四、操作方法1 按配方先后配制1000mL发酵培养基，调pH7.
7、5，装入发酵罐中，包扎好各个进气口、出气口和取样口，保持121下灭菌30mins，结束后取出放在发酵罐台上冷却。2 待发酵点中的培养基冷却至37（E.coli）或30（P.dacunhae 20147）左右时，用火环接种法将E.coli和 P.dacunhae 20147种子液接发酵罐中，接种量1015%，控制温度37或30，转速约为300rpm，空气流速1L/min，发酵培养时间E.coli约12h、20147约18h，其中每间隔1-2hr取样测pH值和OD660值（样品进行适当稀释）纪录发酵全过程中pH值和发酵液颜色变化，过程中镜检菌体生长形态变化情况。3 发酵结束后放罐、收集发酵液并测量
8、其总体积（V）。吸取1 mL发酵液于离心管中，放入台式高速离心机中离心，转速8000 rpm，时间10 min，测湿菌体重（W）计算发酵产菌率。五、实验记录E.coli发酵：时间（h）0246789101112OD640pH颜色 发酵初始时 发酵6h 发酵结束时20147发酵：时间（h）024681012141618OD640pH颜色 发酵初始时 发酵6h 发酵结束时六、思考与讨论1 发酵培养基中碳、氮源是什么？为什么采用富马酸、L-谷氨酸为碳源？2 如何提高发酵效率。3 讨论酶合成生产的调节方式。实验三 高速冷冻离心机的使用方法一、 目的要求1 了解高速冰冻离心机的结构、使用方法及注意事项。
9、2 掌握生物物质、微生物菌体离心分离的原理。二、 原理离心机是利用离心力对混合溶液进行分离和沉淀的一种专用仪器，高速冰冻离心机在实验室分离和制备工作中是必不可少的工具，其最高速度可以达到25000 rpm，最大离心力可达89000g。这类离心机通常带有冷却离心腔的制冷设备，温度控制是由装在离心腔内的热电偶检测离心腔的温度。高速冰冻离心机有多个内部可变换的角式或甩平式转头，它们大多用于收集微生物菌种细胞碎片，大的细胞器以及一些沉淀物等。三、 试剂与器材 E.coli发酵液、天平、高速冰冻离心机、离心管四、操作方法1 使用前先检查调速旋钮、定时旋钮等是否在“0”处，离心管是否泄漏。2 选择合适的转
10、头安装到离心腔内承载转头的轴上。3 接通电源，打开电源开关。4 将待离心的液体装入合适的离心管中，盛量不宜过多（占管的2/3体积）以免益处，盖上离心管盖，精密平衡离心管，并对称的放入转头中。5 调节速度旋钮和定时旋钮，至所需的速度和时间。6 打开起动开关，并观察离心机上的各个指示仪表是否正常工作。7 离心结束后自动关机、关闭冷冻开关、电源开关、切断电源。8 将转头取出，将离心机的盖子敞开放置。9 收集离心物，洗净离心管。五、实验记录： 发酵液体积 ，湿菌体重量 ，单位体积菌体得率 ，六、注意事项1 高速离心机的转头是镶置在一个较细的轴上，因此精密的平衡离心管及内含物是十分重要的。2 当转头只是
11、部分装载时，管子必须相互对称的放在转头上，以便使负载均匀地分布在转头的周围。3 装载溶液时，要根据离心管的具体操作说明进行，要根据离心液体的性质、体积选择合适的离心管，液体不得装的过多，以防离心时甩出，造成转头生锈或者腐蚀。4 每次使用时，要仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时不能碰撞，避免造成伤痕。转头长时间不用时，要涂一层光蜡保护。5 转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。6 离心过程中不得随意离开，应随时观察李新机上仪表是否正常工作，并注意声音有无异常，以便及时排除故障。实验四 固定化生物催化剂的制备一、 目的要求1 学会卡拉胶固定大肠杆菌的
12、操作方法2 了解工业化固定生物催化剂的工艺过程二、 原理酶和细胞固定化方法主要有吸附法、包埋法、共价键结合法和交联法等。本实验通过卡拉胶包埋法固定大肠杆菌细胞，掌握包埋法固定细胞的操作方法。卡拉胶是由角叉菜提取的一种多糖，它含有许多硫酸根多糖，在K+存在下，它能立即发生凝胶作用，由此形成的固定化颗粒能在磷酸缓冲液和其他电解质溶液中使用，其稳定性不受影响。卡拉胶包埋法即温和又简单，可供多种酶和细胞固定化使用。三、 试剂及器材大肠杆菌细胞、卡拉胶、KCl、电炉、天平、恒温水裕锅、量筒、小刀、烧杯四、 操作方法1 配制4%卡拉胶水溶液（A），并冷却至5560。2 配制菌悬液（B），按湿细胞重与蒸馏水
13、为1：1（g/mL）配制，并预热至5560。3 将A与B按4：1（mL/mL）混匀，冷至10使凝胶强化，把所形成的凝胶浸在0.3MKCl溶液中。4 取出凝胶切成55mm大小的小块。5 测定固定化细胞颗粒的密度、床层空隙率、计算单位体积或重量固定化颗粒中细胞包埋量。五、实验记录：固定化细胞重量 ，六、 思考与讨论影响卡拉胶固定化细胞颗粒机械强度的因素有哪些？实验五 游离细胞与固定化细胞酶活比较一、 目的要求掌握酶活测定和计算方法二、 原理 天门冬氨酸酶是催化富马酸和氨转化形成L-Asp的酶：测定发酵过程中游离细胞酶活和固定化E.coli细胞酶是评价发酵培养条件和固定化方法对大肠杆菌生产L-Asp能力影响的重要指标之一。三、试剂与器材1 试剂：富马酸、氨水2 器材：752分光光度计、离心机、电炉、三角瓶、烧杯四、 操作方法1. 富马酸标准曲线制作（
