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1、蛋白激酶C在大鼠重症急性胰腺炎中的表达 【摘要】 目的: 探讨蛋白激酶C(PKC)家族成员PKC和PKC在重症急性胰腺炎(SAP)大鼠胰腺及肺脏中的动态表达情况和组织病理改变的关系. 方法: 胰胆管逆行注射牛黄胆酸钠制成大鼠SAP模型,观察胰腺及肺脏病理学变化,采用免疫组织化学方法分别检测PKC,PKC在SAP大鼠胰腺和肺脏中的表达情况,并进行对比分析. 采用逆转录多聚酶链反应(RTPCR)检测96只大鼠胰腺组织中PKC mRNA的表达情况. 结果: 建模后1,6,12和24 h假手术(SO)组胰腺中PKC表达分别为0.700.04,0.710.05,0.750.04和0.710.07;SAP
2、组分别为0.830.05, 0.950.09, 1.100.10和1.080.16,两组各时间点之间差异均有统计学意义(P0.01). 轻型急性胰腺炎(MAP)组大鼠建模后胰腺中PKC表达分别为0.730.04, 0.730.03, 0.850.08和0.840.06,与SO组各时间点相比,在12 h和24 h差异具有统计学意义(P0.05),与PKC相类似,PKC的表达在1 h开始增高,12 h达到高峰,且维持时间较长. MAP组PKC在12 h达到高峰,但维持时间较短,24 h时有所减低. 结论: PKC在SAP的病程发展中起重要作用. 监测PKC水平可为SAP的早期诊断提供帮助. 【关键
3、词】 胰腺炎;信号传导;蛋白激酶C;逆转录聚合酶链反应 0引言 近年来,重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)的研究多集中在炎症因子通过信号传导引发全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS) ,并渐进发展成为多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrame, MODS)上,但对于SAP的早期诊断仍缺乏特异性指标. 已有研究1-2证实蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)可调控多种促炎因子(IL1,IL12,TNF和NFB等)
4、的活化,测定血清IL12水平能预测SAP的预后,对其早期诊断具有重要意义3. 我们采用免疫组织化学法和RTPCR法测定PKC在SAP中的表达水平,以探讨PKC在SAP中的作用机制,为临床诊治SAP提供依据. 1材料和方法 1.1材料清洁级SD大鼠96只(雌雄各半),体质量220260 g,(甘肃省中医学院实验动物中心),实验前12 h禁食,自由饮水. 牛黄胆酸钠(美国Sigma公司);一步法总RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen公司);一步法反转录聚合酶链式反应(RTPCR)试剂盒(大连宝生物公司);即用型 SABC免疫组化染色试剂盒,兔抗 PKC,鼠抗 PKC和DAB显色试剂
5、盒(武汉博士德公司). 1.2方法 1.2.1实验分组96只SD大鼠随机分为假手术(sham operation,SO)组、轻型急性胰腺炎(mild acute pancreatitis,MAP)组和SAP组,每组动物32只. 1.2.2模型制作MAP组大鼠术前禁食12 h,自由饮水,戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔麻醉,无菌条件下上腹正中切口进腹,于十二指肠内侧见片状分布的胰腺,肝门部胆胰管用无损伤动脉夹夹闭,从胆胰管开口十二指肠系膜缘对侧肠壁穿刺插入导管,导管进入肠腔后对准膨大壶腹中心插入胆胰管约1 cm,用微量泵以0.1 mL/min速度推注20 mL/L牛磺胆酸钠1 mL/kg,推注完毕
6、后无损伤动脉夹夹闭胰胆管壶腹部观察10 min后拔管,去除动脉夹,缝合十二指肠穿刺口并关腹. SAP组用微量泵以0.1 mL/min速度推注50 mL/L牛磺胆酸钠1 mL/kg, 其余步骤同MAP组. SO组开腹仅轻轻翻动胰腺,关腹后皮下注射40 mL/kg生理盐水. 1.2.3取材和评分各组动物在建模后于 1,6,12和24 h四个时间点,(各时间点8只动物)以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,经原切口入腹,无菌条件下取胰腺和肺脏,分别保存于40 g/L甲醛及-80冰箱,按文献4的方法,由病理医师对大鼠胰腺及肺脏组织在光镜下按水肿、出血、感染和坏死四方面的轻重程度进行盲法病理评分. 1.2.4免疫组
7、织化学染色切片脱蜡至水,pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复,室温下3 g/L H2O2孵育30 min,山羊血清封闭背景,加兔抗 PKC多克隆抗体及鼠抗 PKC mAb(150) 4过夜,滴加二抗 37孵育1 h,加链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物,室温孵育1 h,DAB显色,苏木素复染细胞核,乙醇脱水. 阴性对照以 PBS代替一抗.1.2.5RTPCR检测取组织100 mg匀浆后加入1 mL总RNA提取试剂,抽提组织总RNA,紫外分光光度仪测定标本RNA纯度,以甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参照扩增 PKC及 PKC. 所有引物均由上海生物工程公司合成,PKC引物序列: 上游5g
8、ggatgaaatgcgacacc 3,下游 5ctctgagacgccgaagga 3, 退火温度 56,共循环30次,产物长度300 bp;PKC引物序列:上游5ctgtggcactttgctctg 3下游 5ttctgggtcacttggttc 3退火温度 54,共30个循环,产物长度 153 bp;内参照 GAPDH引物序列:上游 5tacagatcacgaaagcatagagga 3下游 5tccattcgttcctgaacagcgaca 3退火温度 54,共30个循环,产物长度411 bp;取RTPCR扩增产物4 L,加上样缓冲液1 L,在15 g/L琼脂糖凝胶上电泳,电泳条件为电
9、压100 V, 60 min,凝胶图像分析系统分析,以目的基因与内参照GAPDH产物比值代表该样品PCR产物的相对含量. 统计学处理:采用SPSS11.5统计软件进行数据的统计分析,各组计量资料以xs表示,组间比较用单因素方差分析,P0.05为差异具有统计学意义. 2结果 2.1大鼠胰腺和肺脏组织中PKC阳性细胞的表达SO组中可偶见PKC和PKC阳性细胞,且主要在细胞浆中表达. MAP组PKC和PKC阳性细胞在胰腺和肺泡胞浆及胞膜中均有表达. SAP组PKC和PKC在胰腺及肺泡细胞膜中表达均呈强阳性. SAP组1,6,12和24 h四个时间点PKC表达分别为 766.009.79,799.13
10、12.80,821.3815.81和816.1324.48;PKC表达分别为747.1410.23,775.9114.30,797.5011.32和794.3514.71,较 SO组明显升高,而MAP组低于 SAP组,三组各时间点差异均具有统计学意义(P0.05). MAP组中PKC和 PKC于6 h开始升高,12 h达到高峰,此后有所下降. SAP组 PKC和 PKC于1 h即开始升高,12 h达到高峰(图1,2). 2.2PKC mRNA,PKC mRNA的表达水平结果显示,RTPCR所得到的PKC,PKC和 GAPDH产物长度分别为PKC 300 bp,PKC 153 bp和GAPDH
11、411 bp. PKC mRNA和PKC mRNA表达量MAP组高于 SO组,SAP组高于MAP组,三组间各时间点差异具有统计学意义(P0.05,表 1,图3). A: SO组; B: MAP组; C: SAP组. 图124 h PKC在大鼠胰腺中的表达SABC 400(略) A: SO组; B: MAP组; C: SAP组. 图224 h PKC在大鼠肺脏中的表达SABC 400(略) 表1RTPCR法检测胰腺中PKC mRNA,PKC mRNA表达(略) aP0.05, bP0.01 vs SO; dP0.01 vs MAP. SO: 假手术; MAP: 轻型急性胰腺炎; SAP: 重症急
12、性胰腺炎. M: marker; 14: SO组1,6,12,24 h; 58: MAP组1,6,12,24 h; 912: SAP组1,6,12,24 h. A: 各组胰腺组织中PKC和GAPDH的RTPCR产物电泳结果; B: 各组胰腺组织中PKC和GAPDH的RTPCR产物电泳结果. 图3各组胰腺组织中的RTPCR产物电泳图(略) 3讨论 PKC调控炎症因子的作用近年来逐渐受到重视. Lallena等5研究发现在静息细胞内,PKC与IB激酶相结合,PKC是IB激酶的直接激活剂,推测PKC很可能激活IB的激酶,后者使IB磷酸化而与NFB解离,同时激活NFB. PKC在TNF信号转导中起关键
13、作用, TNF可通过磷脂酶产生脂质第二信使,并引发一系列信号转导. 刘刚等6发现急性胰腺炎患者血中PKC的水平明显较对照组增高,这与我们的研究结果相一致. Miriam HorovitzFried的研究指出抑制PKC会减少IB的磷酸化和NFB的激活,进一步减少炎症因子的释放,而且 PKC可以影响 PKC的表达7. 我们的实验结果提示,在造模后各组间 PKC变化略慢于PKC,强度上也弱于 PKC,我们推测PKC可能在SAP发病的早期过程中并不起主要作用. 我们观察到SAP组PKC的激活较早,而且24 h仍维持较高水平,MAP组PKC在12 h才开始升高,且活性变化有自限性. 据此我们推测: MA
14、P早期PKC不激活或者激活很少,从而不会引发SIRS反应,在SAP发生早期,大量激活的PKC引起炎症因子的级联瀑布效应导致全身感染是SAP患者死亡的主要原因. 因此,PKC的监测可以较早的反映SAP病程的进展,PKC或许可以成为SAP早期诊断的指标. 另外,PKC抑制剂在一些炎症性疾病中起治疗作用,有研究8表明蛋白激酶抑制剂可以减轻重症胰腺炎肺损伤程度,这些可能与PKC对中性粒细胞的调节相关联. 有关抑制PKC是否有治疗重症胰腺的作用有待进一步研究. 【参考文献】 1 王孝养,熊维宁,徐永健,等. 核因子B和蛋白激酶C对哮喘Th类细胞因子表达的调控J . 中华结核和呼吸杂志,2001, 24(
15、6): 355-359. 2 Tando Y, Algul H , Wagner M, et al. Caeruleininduced NFkappa B/Rel activation requires both Ca2+ and protein kinase C as messengersJ. Am J Physiol, 1999, 277:678-686. 3 马东瑞,李伟,张晓华,等. 白介素IL2与大鼠急性坏死性胰腺炎严重程度的关系J. 第四军医大学报,2005,26(20):1885-1887. 4 秦兰芬,吴建新,袁耀宗,等. 大鼠急性坏死型胰腺炎病理特征评定方法的研究J. 中国实验动物学报,2002,10(4):210-213. 5 Lallena MJ, Diaz Meco MT, Bren G, et al. Activation of IkappaB kinase beta by protein kinase C isoformsJ. Mol Cell Biol, 1999 ,19
