简并引物的设计

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1、简并引物设计方法及原则简并引物常用于从已知蛋白到相关核酸分子的研究及用于一组引 物扩增一类分子。简并引物设计方法(1) 利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白质或cDNA编码 的氨基酸序列因为密码子的关系,不同的核苷酸序列可能表达的氨基 酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI 的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使 用BLASTP(通过蛋白查蛋白)，在整个NR数据库中查找与之相似的氨 基酸序列。(2) 对所有的序列进行多序列比对 将搜索到的同一基因的不同氨 基酸序列进行多序列比对，可选工具有ClustalW/X,也可在线分析。 所有序列

2、的共有部分将会显示出来。 “*”表示保守， “：”表示次 保守。(3) 确定合适的保守区域 设计 简并引物至少需要上下游各有一 个保守区域， 且两个保守区域相距50400 个氨基酸残基为宜， 使得 PCR产物在1501200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个 氨基酸的保守区，因为每条引物至少 18bp 左右。若比对结果保守性不 是很强很可能找不到 6 个氨基酸序列的保守区，这时可以根据物种的 亲缘关系，选择亲缘关系近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到 要求，则需进行三次比对，总之，究竟要选多少序列来比对，要根据 前一次的结果反复调整。最终目的就是有两个6 个氨基酸且两者间距 离合适

3、的保守区域。(4) 利用软件设计引物 当得到保守区域后，就可以利用专业的软 件来设计引物了， 其中 Primer 5.0 支持简并引物的设计， 将参与 多序列比对的序列中的任一条导入 Primer 5.0 中，将其翻译成核苷 酸序列， 该序列群可用一条有简并性的核苷酸链来表示(其中 R=A/G,Y=C/T,M=A/C, K=G/T, S=C/G, W=A/C/T, B=C/G/T,V=A/C/G, D=A/G/T, N=A/C/G/T, 该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找 到的氨基酸保守区域的对应部分，在 Primer 5.0 中修改参数，令其 在两个距离合适的保守的 nt 区域内寻找引

4、物对，总之要保证上下游引 物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。(5) 对引物的修饰 若得到的引物为：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3贝U简并度=4X2X4X3X4X3X2=2304,很明显该条引物的简并 度很高不利于PCR,可以通过次黄嘌吟代替N(因为次黄嘌吟可以很好 的和4种碱基配对)和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度。这样设计出来的简并引物对,适用于比对的氨基酸序列所属物种 及与这些物种分类地位相同的其他物种。简并引物设计原贝从蛋白到核酸，请注意：1) 尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物设计区,如蛋氨酸和色 氨酸仅有一个密码子。2) 充分注意物种对密码子的偏好性,选择该物种使用频率高的密 码子,以降低引物的简并性。3) 引物不要终止于简并碱基,对大多数氨基酸残基来说,意味着 引物的3末端 不要位于密码子的第三位。4) 在简并度低的位置，可用次黄嘌吟(di)代替简并碱基。 以上几点遵循的总的原贝为： 尽量降低引物的简并度,尤其在3末端或近 3末端。