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1、红景天与葛根水提取物对微粒体LPO模型的影响李嘉琳，海春旭，梁欣，刘瑞，于洋【关键词】红景天；葛根；抗氧化；脂质过氧化；氧电极EffetsfRhdilaandPuerarianperxidativedaagedelinirse【Abstrat】AI:TinvestigatetheantixidativeatinftheaterextratsfRhdilaandPueraria,andthedseeffetrelatinship.ETHDS:SpragueDaleyratserekilledandthentheliversererevedtpreparehgenateandislatetheir
2、sebyaliuinpreipitatin.TheaterextratsfRhdilaandPuerariaereextratedbydeting.ThreelipidperxidatindelsereinduedbyV/Fe2+,HPandNADPHADP/Fe2+.The2differentextratsereaddedintthe3delsrespetivelytbtainthefinalnentratinsf25,12.5,6.25,3.13,1.56g/L.Thenthententsfalndialdehyde(DA)ereexainedfranalyzingtheantixidat
3、iveatinfextratsintheV/Fe2+,HPstiulateddels.xygrapheletrdeasusedtdeterinetheinhibitinratefxygenuptakeinNADPHADP/Fe2+del.RESULTS:InV/Fe2+del,the2extratsshedthehighestinhibitinrateatthenentratinf6.25g/L.IntheHPdel,thententfDAingrupsith3.13t25g/LfPuerariaextratdereasedsignifiantlyP0.05.InNADPHADP/Fe2+de
4、l,thehighestinhibitinratesftheRhdilaandPuerariaaterextratsreahed43.07%and75.09%.NLUSIN:The2aterextratshavegdantixidativeeffets.ThePuerariaaterextrathasaparativelystrngereffetinthedelsinthepresenefenzyes,nversely,Rhdilaaterextrathasastrngereffetinthedelsintheabsenefenzyes.【Keyrds】rhdila；pueraria;anti
5、xidative;lipidperxidatin;eletrdexygraph【摘要】目的：讨论红景天与葛根水提物的抗氧化作用及其剂量反响关系.方法：煎煮法制备红景天和葛根水提物.钙沉淀法提取雄性SD大鼠肝微粒体.采用三种激发剂V/Fe2+,HP和NADPHADP/Fe2+建立微粒体脂质过氧化LP模型，参加不同浓度的红景天、葛根的水提物，观察两种中药的抗氧化作用.在V/Fe2+，HP模型中通过比色法测定对丙二醛的抑制作用，NADPHADP/Fe2+模型通过氧电极法测定对耗氧量的抑制作用.结果：在V/Fe2+模型中，两者在浓度为6.25g/L时有最大抑制率.在HP模型中，葛根水提物在3.1325
6、g/L范围内其DA含量低于对照组P0.05.在NADPHADP/Fe2+模型中，红景天、葛根水提物的抑制率分别到达43.07和75.09.结论：两种中药的水提取物都具有较强的抗氧化作用，并存在一定的剂量效应关系.其中葛根水提物对酶参与性反响的抑制作用强于红景天水提物，而在非酶参与性反响中，红景天水提物的作用更强.研究结果为两种中药在自由基损伤保护作用的机制提供了实验根据.【关键词】红景天；葛根；抗氧化；脂质过氧化；氧电极0引言随着自由基医学的不断开展，人们逐渐意识到自由基在人类多种疾病的发生开展过程中扮演着重要的角色.与此同时，寻找有效、无毒副作用的自由基去除剂也成为人们关注的问题.其中具有生
7、物学活性的自由基去除剂挑选模型，包括V/Fe2+,过氧基异丙苯HP和四氯化碳l4的刺激模型被成功应用，尤其是在中药提取物的抗氧化活性的测定中发挥了重要作用.本实验提取了红景天、葛根的水提物，应用多种微粒体抗氧化剂挑选模型研究两种提取物的抗氧化剂量反响关系.1材料和方法1.1材料二级雄性SD大鼠20只，体质量180200g，第四军医大学实验动物中心提供.硫代巴比妥酸thibarbituriaid,TBA，HP,NADPH,ADP均为Siga产品；DA标准品为erk产品；考马斯亮蓝，牛血清白蛋白为华美试剂公司产品；其他化学试剂均为AR试剂；3K30型台式高速冷冻离心机Siga；Y2型测氧仪及氧电极
8、(上海新华仪器厂)；501型超级恒温器(重庆实验设备厂)；722型光栅分光光度计山东高密分析仪器厂，台式自动平衡记录仪(上海大华仪表厂).大花红景天、葛根一级品，各500g，购于西安万寿路药材市场.1.2方法1.2.1微粒体及提取物的制备钙沉淀法制备大鼠肝脏微粒体1.采用煎煮法制备红景天、葛根水提物2.取中药材，参加8倍重量的水煎煮1.5h后，过滤，药渣再经5倍重量水煎煮1h，得水提液.得到水提液趁热过滤，过滤液继续加热，蒸发掉水分得到水提稠膏经80烘干，备用，检测水分小于5%.置于枯燥器内保存.1.2.2微粒体V/Fe2+脂质过氧化激发模型采用本科室的常规方法.反响体系中的根本缓冲液为Tri
9、sHl(0.1l/L，pH=7.4)与Kl0.15l/L按12比例混合配制.700L/L乙醇溶解红景天提取干粉，制成5个剂量组，浓度为25，12.5，6.25，3.13，1.56g/L.每组3个平行样.同时，设空白对照及阳性对照用蒸馏水替代红景天提取物，阳性对照设3个平行样.反响体系中含缓冲液0.8L，50l/LFeS40.15L，5l/L抗坏血酸0.15L，微粒体悬液和不同浓度的提取物各0.2L，37水浴15in，100g/L三氯醋酸3.0L终止反响，3000rin离心10in，取上清2L参加2L6.7g/LTBA，100水浴15in，流水冷却，以空白对照调“零，E535n比色，读取D值.同
10、时用不同浓度的DA标准品作标准曲线，拟合标准直线方程，由此计算各组的DA含量.1.2.3微粒体HP脂质过氧化激发模型缓冲液的配制、分组及步骤同1.2.2.反响体系中含缓冲液1L,1l/LHP0.15L，微粒体悬液0.2L和不同剂量的提取物0.15L.1.2.4微粒体NADPHADP/Fe2+体系中耗氧量氧电极法的测定参考文献3-4，采用Y2型测氧仪及氧电极连接台式自动平衡记录仪，自制3L反响池，循环水温度37，磁力搅拌速度恒定在60r/in，灵敏度1/8.反响体系：NADPH:0.0375l/L；ADP:0.927l/L；Fe2+:9.375l/L；微粒体0.365gprtEin/L以上浓度均
11、为终浓度，用根本缓冲液补足3L.设3个剂量组，每组设3个平行样.1.2.5耗氧量及抑制率的计算5DA生成抑制率阳性对照DA-样品DA/阳性对照DA100；耗氧量l/gin241(l/L)斜率(/in)/扩展蛋白浓度g/L；耗氧抑制率阳性对照耗氧量-样品耗氧量/阳性对照耗氧量100.统计学处理：所有数据用xs表示，数据处理采用SPSS11.5统计分析软件进展，浓度与抑制率之间的关系采用线性回归分析.多组间比拟采用KruskalallisH检验，两两比拟采用ilxn秩和检验.P0.05认为有统计学差异.2结果2.1V/Fe2+激发的LP模型与阳性对照组相比，红景天、葛根提取物各给药浓度下DA含量显
12、著降低P0.01，分别在12.5和3.13g/L浓度下有最大抑制率.红景天组在各个给药浓度下其DA抑制率均显著高于葛根组(P0.05，表1).表1红景天、葛根提取物对V/Fe2+，HP，NADPHADP/Fe2+激发的LP模型的影响(略)aP0.05,bP0.01vs阳性对照；P0.05,dP0.01红景天vs葛根.2.2HP激发的LP模型与阳性对照组相比，红景天、葛根提取物各给药浓度下DA含量显著降低P0.05，葛根组P0.01，分别在1.56和25g/L浓度下有最大抑制率.红景天组在两个较低给药浓度下其DA抑制率显著高于葛根组P0.05，而其他三个浓度下均显著低于葛根组P0.05.其各给药
13、浓度与抑制率之间的决定系数R2分别为0.6073和0.9799表1.2.3NADPHADP/Fe2+激发的LP模型在1.56,6.25,25g/L三个给药浓度下两种提取物对NADPHADP/Fe2+激发的LP模型的耗氧量抑制率均显著低于对照组.红景天组在两个较低给药浓度下其耗氧量抑制率显著低于葛根组P0.05.其各给药浓度与抑制率之间的决定系数R2分别为0.9723和0.9994表1.3讨论红景天(Rhdila)和葛根Puerariaa是两种富含黄酮类5和异黄酮类的中草药.它们作为抗氧化剂应用在多种疾病的治疗与预防中6-7.目前的研究多为针对两者的活性成分单体如红景天苷、百脉根苷8和葛根素9进
14、展抗氧化作用研究.但是，由于自由基反响具有链式的特性，而使单一的抗氧化剂在体内体外实验中都无法到达预期的效果.另外，挑选和测定抗氧化活性也受到试验模型的限制.整体实验不能说明详细机制，化学反响又不代表生物体系的实际情况，本研究采用微粒体脂质过氧化模型，不仅能观察到被测物质在生物体内的反响性，量效关系，而且还能知道详细的反响机制.因此具有明显的优点.本实验主要针对红景天和葛根水提物在体外微粒体脂质过氧化模型中的反响性，测定抗氧化作用的活性强度，以及剂量效应关系，为进一步讨论其药理作用及结合应用提供实验与理论根据.微粒体是细胞内质网的碎片，含有混合功能氧化酶系统包括细胞色素氧化酶P450(YP45
15、0)，黄嘌呤氧化酶等多种同功酶，参与内源性和外源性化合物代谢.生物体在需氧代谢过程中的氧化复原反响伴有超氧阴离子自由基、羟自由基等生成，可以引发生物膜多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反响从而导致一些疾病衰老、心血管并炎症、肿瘤等的发生，因此研究中药有效成分的抗氧化作用对预防、治疗这些疾病可能发挥重要作用.本研究采用的三种微粒体LP模型分别代表了不同的激发体系，V/Fe2+，HP激发体系代表非酶参与性反响，其中V/Fe2+代表无机物激发剂，HP代表有机物激发剂；NADPHADPFe2+代表酶参与性反响，此体系中包括黄嘌呤氧化酶，NADPH脱氢酶等酶促反响.维生素与二价金属离子，通过Fentn反响，生成超氧阴离子自由基和羟自由基.脂质过氧化反响的结果是自由基攻击多不饱和脂肪酸plyunsaturatedfattyaids,PUFA裂解生成DA等终产物，同时伴随氧的消耗.因此测定脂质过氧化终产物DA或耗氧量的变化能较好地反映脂质过氧化的程度.结果说明，红景天和葛根水提物对三种LP模型都有一定的抑制作用.两种提取物虽然对非酶与酶参与性反响均有较强作用，但是作用机制并不一样.与葛根提取物相比，红景天能更好的去除超氧阴离子自由基和羟自由基.但是在HP模型中，虽然两者的最高抑制率接近，但是葛根有较好的剂量反响关系.但是，葛根对耗氧量的抑制作用要强于红景
