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1、MTT比色法检测露蜂房蛋白对白血病细胞增殖的影响张雪莉张圣明时彦王强苗乃法【摘要】目的：研究露蜂房蛋白对白血病细胞增殖的影响，为白血病的治疗提供新的药物。方法：制备红白血病小鼠模型，采用TT法检测露蜂房蛋白对白血病细胞增殖的作用。结果：露蜂房蛋白低浓度处理组与生理盐水组相比无明显差别，中浓度处理组与生理盐水组比较对白血病细胞有抑制作用，两组间具有统计学意义，与化疗药物(柔红霉素)相比还有差距。结论：露蜂房蛋白对白血病细胞具有抑制增殖的功效。【关键词】TT比色法露蜂房蛋白增殖据医籍记载，露蜂房具有祛风、攻毒、杀虫等功效。其成分较为复杂，目前研究较多的是蜂胶，对其蛋白成分的研究报道甚少。本实验采用
2、TT法观察露蜂房蛋白对红白血病细胞增殖的影响。1材料与方法1.1材料1.1.1TT：购于美国Siga公司；三联溶解液：SDS异丁醇盐酸；RPI1640：美国Gib产品；新生牛血清：杭州江滨生物技术有限公司；二甲基亚砜（DS）：美国Siga产品。1.1.2仪器酶标仪；二氧化碳培养箱；S-J-2FD型双人单面净化工作台：苏州。1.1.3EL9611细胞株：天津血液病研究所；露蜂房蛋白（NidusvespaePrtEin,NVP）：自制。1.1.4动物健康的BALB/小鼠30只，68周龄，体重为1822g，雌雄不限。1.2实验方法1.2.1红白血病小鼠模型制备的方法1：将红白血病细胞株用生理盐水洗3
3、次，尾静脉接种给健康的BALB/小鼠，接种细胞数为2106/只。接种后的小鼠进行动态观察，每隔3天尾静脉取血，涂片，常规瑞氏染色。并注意观察小鼠的表现，如精神状态、毛光泽度等。在外周血中发现有核红细胞则可确定为小鼠白血病模型复制成功，待小鼠濒危时，再取尾静脉血，涂片，常规瑞氏染色。确定小鼠发病后无菌条件下取发病小鼠的脾，置于200目铜滤网上，用针拴轻轻研磨，制成细胞匀浆。以生理盐水冲洗滤网，4号针头过滤，使成单细胞悬液。调整细胞浓度：胎盘兰染色计数活细胞，活细胞率98%，细胞悬液的浓度为107/l。1.2.2改良TT比色法检测细胞增殖2取发病小鼠的脾细胞悬液，将106107/l发病小鼠脾的单细
4、胞悬液按90l/孔接种于96孔微量培养板内，然后加入药液10l/孔，设高、中、低3个浓度(每个浓度相差10倍)组，即生理盐水组，柔红霉素阳性对照组，每组设3个复孔。每块板设一个空白调零孔，内加培养液，不含细胞与药物。接种完毕后在37，5%2饱和湿度培养箱内孵育培养72h。加TT：加TT溶液10l/孔，混匀后37，5%2饱和湿度培养箱内孵育4h。加溶解液：加三联溶解液100l/孔，混匀后37放置过夜以溶解甲月赞。吸光度（D）测定：用酶标仪测定每孔吸光度，测定波长为450n。肿瘤细胞抑制率的计算：肿瘤细胞抑制率=(对照组D值-治疗组D值)/对照组D值100%。1.3统计学处理：用SAS8.0统计软
5、件对所获数据进行分析，经检验资料符合正态方差齐条件，故使用方差分析取=0.05对数据进行检验。2结果经方差分析检验可知，P0.0001，在=0.05水平上，有统计学意义，各处理组间存在差别，可以认为生理盐水、NVP低浓度、中浓度、高浓度及柔红霉素对白血病小鼠脾组织白血病细胞的抑制增殖作用不全相同。经两两比较可知，NVP低浓度处理组肿瘤细胞抑制率为103%（表1），经方差分析（表2），在=0.05水准上，NVP处理组低浓度组和生理盐水对照组没有统计学意义（P0.05），可以认为NVP低浓度处理组对白血病小鼠脾组织白血病细胞没有明显抑制增殖的作用；中浓度组和高浓度组其肿瘤细胞抑制率分别为42.7%
6、和50.1%，经方差分析可知，在=0.01水准上，与生理盐水对照相比有显著的统计学意义（P0.01），NVP高浓度处理组和NVP中浓度组之间没有统计学意义（P0.05），可以认为中浓度组和高浓度组均有显著抑制肿瘤细胞增殖的作用；柔红霉素阳性对照组的抑制率为84.3%，高浓度组与柔红霉素阳性对照组相比仍具有统计学意义（P0.01），可以认为高浓度组与柔红霉素组效果不相同。NVP处理组对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，但药效仍低于柔红霉素阳性对照组对肿瘤细胞的抑制效果。表1TT比色法检测NVP对脾细胞增殖的影响（略）注：*与生理盐水对照组相比，P0.01；与中浓度组相比较，P0.01。表2TT比色法检
7、测白血病细胞增殖的数据方差分析结果（略）表3TT比色法检测白血病细胞增殖的SNK-q两两检验结果（略）3讨论露蜂房为胡蜂科昆虫大黄蜂及同属近缘昆虫的巢，具有祛风、攻毒和杀虫等功效，随着现代研究的不断深入，逐渐弄清了其组成物质，并且分离出许多化学成分。前期研究表明露蜂房水溶性蛋白在体外对白血病细胞K562细胞、骨髓单个核细胞（BN）具有抑制增殖，促进凋亡的作用35，我们现在对其进行体内实验研究。图1TT法检测NVP各组抑制白血病细胞增殖结果（略）TT比色法是一种检测细胞存活和增殖的方法，现在已经广泛应用于肿瘤细胞化学敏感性及放射性敏感性测定、免疫细胞生长增殖及毒性测定、细胞因子生物活性测定等6，
8、7。吸光值低于对照组提示细胞增殖降低，反之亦然。传统的实验多采用DS溶剂溶解，但是沉淀产物溶解很不完全，由此增加的处理步骤不但繁琐，而且会使可靠性降低，因此，许多研究者都在探索改良方法，寻找新的溶解剂。本实验采用改良TT比色法2进行露蜂房蛋白对白血病细胞增殖抑制的测定，结果表明露蜂房蛋白低浓度处理组与生理盐水组相比无明显差别，中浓度组处理组与生理盐水组比较对白血病细胞有抑制作用，两组具有统计学意义，但与化疗药物柔红霉素相比还有差距。但是有关露蜂房蛋白有效成分及作用机理尚需做进一步的探讨。【参考文献】1丁顺利,褚建新,赵钧铭,等.可移植性BALB/小鼠红白血病模型的建立及其生物学特性.中华血液学
9、杂志,1998,19(12):638641.2周建军,乐秀芳,韩家娴,等.评价抗癌物质活性的改良TT方法.中国医药工业杂志,1993,24(10):455457.3辛先贵，张圣明，张春燕，等中药露蜂房蛋白对人红白血病562细胞影响的实验研究.中国药理学通报，2005,21(6)：764.4辛先贵，张圣明，时彦，等.中药露蜂房蛋白对人红白血病K562细胞增殖的影响.解剖学报，2006，37（1）：7477.5辛先贵，张圣明，张春燕，等.露蜂房蛋白对急性髓细胞白血病患者骨髓单个核细胞超微结构的影响.电子显微学报，2005，24（1）：6568.6SargentJTheUsefTTassaytstudydrugresistaneinfrenshtnursaples.RenentResultanerRes2003,161:13.7向丽，朱江，曾静.细菌药敏试验TT法与常量稀释法比较性研究泸州医学院学报，2006,29（1）:4546.
