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1、肌酸激酶同工酶MB评估上海仁济医院检验科肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）是由M和B亚基构成的杂化型二聚体，主要存在于心肌细胞的外浆层，是心肌酶谱中最有特异性的酶，从80年代起公认为心肌酶学诊断的“金标准”，应用于急性心肌梗塞（AMI）的早期诊断1，21979年Gerhardt3等人首次报道用免疫抑制原理测定CK同工酶，免疫抑制法以其快速、灵敏、定量且可进行自动分析等优点适合常规检测，随着方法与试剂不断改进与完善，1986年国外已有试剂盒供应，但价格昂贵；最近国内研制成功免疫抑制法测CK-MB的试剂盒，本文旨在对该试剂盒的特性作一评估。材料和方法一、标本来源分正常组，AMI组和非AMI组，非常人
2、血清来自体检健康人员，计30例，AMI组53例，系仁济医院心内科病房已确诊为AMI者，非AMI组系心内科及其它科门诊病人，因胸痛、心率失常等初诊疑拟AMI，后经系列观察和酶学检查证实不是AMI患者，共20例。血标本留取后及时分离血清检测或将检测血清置于-20度冰箱保存至测定。二、试剂 1. 免疫抑制法检测CK-MB试剂盒：上海北加生化试剂有限公司产品 （1） R1：含CK-MB抗体的咪唑缓冲液 （羊抗人CK-M多克隆抗体抑制剂2000U/L，100mmol/L的咪唑缓冲液成pH6.7内含葡萄糖20mmol/L，醋酸镁10mmol/L，EDTA 2mmol/L） （2） R2(A)：酶干粉。 （
3、AMP 5mmol/L，磷酸肌酸 30mmol/L，五磷酸二腺苷 10mmol/L，NADP 2mmol/L，V-乙腺半胱氨酸 20mmol/L，已糖激酶2500U/L，G6PDH500U/L，ADP 2mmol/L）。2. 宝灵曼CK-MB试剂盒：对照用。三、仪器 HITACHI 7150型自动生化分析仪 波长=340nm四、方法 本试验在日立7150生化自动分析仪器上测定，参数表如下： TESTASSAY CODESAMPLE VOLUMER1 VOLUMER2 VOLUMEWAVELENGTHCALIB METHODSTD. (1) CONC. POSZ.STD. (2) CONC. P
4、OSZ.STD. (3) CONC. POSZ.STD. (4) CONC. POSZ.STD. (5) CONC. POSZ.STD. (6) CONC. POSZ.SD LIMITDUPLICATE LIMITSENSITIVITY LIMITSENSITIVITY LIMITABS. LIMIT (INC/DEC)PROZONE LIMITEXPECTED VALUETECH LIMITINSTRUMENT FACTOR CK-MB RATE - A : 45 - 50 5 3 240 100 NO 60 20 NO 340 LINEAR 0 0 0.0 - 1 65 - 28 0 -
5、0 0 - 0 0 - 0 0 - 0 0.1 100 100 0 9000 INCREASE 0 LOWER 0 - 25 100- 1000 1.0 结 果一、线性范围取一高活性CK-MB标本：152.0U/L用生理盐水按1/5、2/5、3/5、4/5、5/5比例稀释，测得其相应活性分别为38.0、81.0、111.0、131.0、152.0，作图（见图1）。呈典型的抛物线曲线，符合免疫比浊法反应原理。图1 试剂盒测定CK-MB线性 同样操作方法，将CK-MB为79.0U/L的病人血清标本用生理盐水按1/5、2/5、3/5、4/5、5/5比例稀释，测得相应活性为18.7、32.5、48.9
6、、65.5、79.0以稀释倍数为X轴，酶活性Y为轴，其线性见图2，可见CK-MB活性在80U/L以下线性良好。图2 试剂盒测定CK-MB线性二、精密度试验分别取低、中、高活性的血清标本（简称低值、中值、高值）。按本法操作，批内重复200次，批间是每天测定一次共10天，表1为本试剂盒对五份血清标本所做的重复性试验，批内：n=60，CV=1.6613.66%，平均6.78%。批间：n=20，CV=6.5911.73%，平均9.16%，基本符合质控要求，显示该试剂盒有效较高的精密度。表1 精密度试验标本 n man min X SD CV(%)批 低值 20 13.0 8.0 10.15 1.39
7、13.66 中值 20 61.4 51.7 55.99 2.81 5.02内 高值 20 168.0 158.0 163.1 2.7 1.66批低值 10 15.0 10.4 12.45 1.46 11.73批高值 10 108.8 90.1 98.73 6.51 6.59三、干扰试验 1. 甘油三酯（TG）干扰试验：采用高脂标本经测定分析物浓度后加入试验样品中。 选取两标本，一为高甘油三酯标本（TG：14.8mmol/L，CK-MB：30U/L），另一为甘油三酯正常标本（TG：1.09mmol/L，CK-MB：32U/L）。将高甘油三酯作为干扰物，按不同比例1/5、2/5、3/5、4/5、5
8、/5加入甘油三酯正常的标本中，随后测CK-MB活性分别为30、31、33、31、30。干扰物加入前后的反应曲线图见图3、4。由于两标本CK-MB接近，仅考虑TG带来的影响，根据图及测得值显示TG在14.8mmol/L以下对CK-MB活性无明显影响。图3 TG加入前反应曲线图 图4 TG加入后反应曲线图2. 胆红素（BIL）干扰试验：选取高胆红素标本（BIL：394.72mol/L，CK-MB：4.1U/L）作为干扰物，按不同比例1/4、1/3、1/2加入胆红素正常（BIL：4.02mol/L，CK-MB：11.0U/L）的标本中，然后分别测胆红素，CK-MB值（见表2），干扰物加入前后的反应曲
9、线见图5、6。由于两标本中CK-MB略有差异，随着干扰物高胆红素加入的同时，低活性的CK-MB亦被带入，须计算理论值，根据测定值与理论值比较及图显示BIL，在209.33mol/L以下对CK-MB活性无明显影响。表2 胆红素对CK-MB的影响干扰物加入比例 1/4 1/3 1/2BIL 104.20 136.76 209.33CK-MB(测定值) 9.7 8.4 7.4CK-MB(理论值) 9.28 8.7 7.55图5 BIL 加入前反应曲线图 图6 BIL加入后反应曲线图3. 溶血干扰试验将8例CK-MB活性增高的标本，先测定CK-MB活性，然后进行人为溶血，得到溶血样品，再进行测定CK-
10、MB活性及血红蛋白浓度，结果见表3。进一步试验，将标本1、4溶血前重复测5次，得136.582.51、27.742.21；溶血后重复测2次，均在X2SD范围内，说明当轻度溶血（Hb200mg/dl）时本试剂盒对CK-MB测定无明显影响；反之严重溶血可致CK-MB活性升高。表3 试剂测定CK-MB活性溶血前后结果比较1 2 3 4 5 6 7 8溶血前 135.1 201.5 27.3 27.3 65.2 69.5 181.9 201.5溶血后 135.8 202.6 27.4 26.1 64.6 70.4 189.5 214.9Hb(mg/dl) 100 100 100 200 200 200
11、 300 500四、与德国宝灵曼同类试剂盒的相关性 60份临床病人血清标本用本试剂和宝灵曼试剂进行CK-MB平行测定，以宝灵曼试剂测得结果为X轴，本试剂测得结果为Y轴，求得线性方程为Y=0.565X-0.5999，线性相关系数为r=0.983（图7）。显出高相关性，上述结果表明二种试剂盒对AMI的临床意义均满意。图7 本试剂（Y）与宝灵曼试剂（X）的相关性五、正常值 本试剂盒测定体检健康人员30名，结果CK-MB为4.962.95U/L(XSD)，取95%的范围，单测u= 1.645得4.963.37(X1.645SD)，正常上限定在10U/L。讨 论肌酸激酶（CK，EC2,7,3,2，），又
12、称肌酸磷酸激酶（CK），是Kuby等于1953年首先从兔骨骼肌中提取的。CK是不稳定的酶，对光、热及高pH敏感，故测定时必须十分注意测定条件，4标本最好用血清，除肝素外采血管中不应加其它抗凝剂，因为它们对CK活性有抑制作用。由于标本在保存中活性缓缓下降（4度，24小时活性丢失10%；25度，1小时丢失10.），最好采用血后能迅速进行测定。如标本需储存，由于CK在室温不稳定，所有标本都因尽快与细胞分离保存在4度，保存时间不应超过24小时；若24小时内不测定需放在-20度冰箱中。本试剂应用美国进口的羊抗人CK-M多克隆抗体，建立并产生了免疫抑制测定CK-MB方法的试剂盒，采用N-乙酰半胱氨酸（NA
13、C）代替谷胱苷肽作为激活物质，其稳定性和溶解性好，而且测定时不会引起蛋白沉淀；并增加DETA作为酶激活剂，避免了使用还原胱甘肽作酶激活剂使CK-MB结果偏低的情况。其原因为还原谷胱甘肽（GSH）中除常混有氧化谷胱甘肽（GSSG）外，本身在保存过程中会部分地被氧化，而血清中存在的谷胱甘肽还原酶（GR）则会催化氧化谷胱甘肽生成还原谷胱甘肽，并同时竞争性地消耗在催化CK-MB过程中产生的NADPH，反应如下： GSSG+NADPH+H+ 2GSH+NADP+，致使CK-MB结果偏低，可造成假阴性结果，另外，单磷酸腺苷（AMP）和二腺苷-5-磷酸（Ap5A）亦是试剂盒不可缺少的成分，血清中腺苷酸激酶（AK）主要来自RBC、PLT、肝和肌肉组织，可催化ADP产生ATP，参与反应，导致CK值
