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1、疟原虫的显微镜检查汪子伟（杭州市第一人民医院中心实验室）疟疾（malaria）是由人类疟原虫(Plasmodium)感染引起的寄生虫病，由雌性按蚊（Anopheles mosquito）叮咬传播。疟原虫先侵入肝细胞内发育繁殖，再侵入红细胞内繁殖，引起红细胞成批破裂而发病。临床上以反复发作的寒战、高热、汗出热退为特点，并常出现贫血、肝脾肿大。因疟原虫虫株、感染程度、机体免疫状况和反应性等差异，临床症状和发作规律表现不一。作为一种古老的疾病，早在公元二千多年前，黄帝内经素问中即有疟论篇和刺论篇等专篇论述疟疾的病因、症状和疗法，并从发作规律上分为“日作”、“间日作”与“三日作”。然而，直到1880年
2、法国人Laveran在疟疾病人血液中发现疟原虫；1897年英国人Ross发现蚊虫与传播疟疾的关系，这时其病因才弄清楚。疟疾是目前世界六大热带病和我国五大寄生虫病之一，危害极大。据世界卫生组织统计，目前仍有92个国家和地区处于高度和中度流行，每年发病人数为1.5亿，死于疟疾者150万人。它主要分布于热带、亚热带各国，我国主要在华南、华中(特别是云南和海南)。我国1949年前疟疾连年流行，尤其南方，流行猖獗，病死率很高。解放后，全国建立了疟疾防治机构，广泛开展了疟疾的防治和科研工作，疟疾的发病率已显著下降。历代战争史实表明疟疾对军事行动影响颇巨，低疟区部队进入高疟区，常发生大量非战斗减员。疟原虫属
3、原生动物亚界-顶复门-孢子纲-疟原虫属。寄生人类的疟原虫有：间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫等。疟原虫通过蚊叮咬而感染人，疟疾的典型临床表现是周期性寒战、发热和出汗。疟疾诊断主要靠外周血涂片检查。疟疾的治疗主要是杀灭红细胞内的疟原虫，目前用的最多的是青蒿素类药物、或与奎宁、咯萘啶、磺胺多辛和乙胺嘧啶等联合用药。一、 疟疾的临床表现间日疟和卵形疟的潜伏期为1315天，三日疟为2430天，恶性疟为712天。疟疾的典型症状为突发性寒战、高热和大量出汗。寒战常持续2060分钟。随后体温迅速上升，通常可达40以上，伴头痛、全身酸痛、乏力，但神志清楚。发热常持续26小时。随后开始大量出汗，体
4、温骤降，持续时间约为30分钟1小时。此时，患者自觉明显好转，但常感乏力、口干。各种疟疾的两次发作之间都有一定的间歇期。早期病人的间歇期可不规则，但经数次发作后即逐渐变得规则。间日疟和卵形疟的间歇期约为48小时，三日疟约为72小时。恶性疟约为3648小时。反复发作造成大量红细胞破坏，可使患者出现不同程度的贫血和脾大。脑型疟是恶性疟的严重临床类型，亦偶见于间日疟。主要的临床表现为剧烈头痛、发热，常出现不同程度的意识障碍。其发生除与受感染的红细胞堵塞微血管有关外，低血糖及细胞因子亦可能起一定作用。低血糖的发生与患者进食较少和寒战、高热时消耗较多能量有关。脑型疟的病情凶险，病死率较高。恶性疟病人于短期
5、内发生大量被疟原虫感染的红细胞破坏，可诱发血红蛋白尿，发生肾损害，甚至引起急性肾衰竭。输血后疟疾的潜伏期多为710天，国内主要为间日疟，临床表现与蚊传疟疾相同，但因无肝细胞内繁殖阶段，缺乏迟发型子孢子，故不会复发。经母婴传播的疟疾较常于出生后1周左右发病，亦不会复发。再燃（recrudescence）是由血液中残存的疟原虫引起的，因此，四种疟疾都有发生再燃的可能性。再燃多见于病愈后的14周，可多次出现。复发（relapse）是由寄生于肝细胞内的迟发型子孢子（hypnozoite）引起的，只见于间日疟和卵形疟。复发多见于病愈后的36个月。二、 疟疾的病原学可感染人类的疟原虫共有4种，即间日疟原虫
6、（Plasmodium vivax）、卵形疟原虫（P. ovale）、三日疟原虫（P. malariae）和恶性疟原虫（P. falciparum）。疟原虫的生活史包括在人体内和在按蚊体内两个阶段。（一）人体内阶段疟原虫在人体内的裂体增殖阶段为无性繁殖期。寄生于雌性按蚊体内的感染性子孢子（sporozoite）于按蚊叮人吸血时随其唾液腺分泌物进入人体，经血液循环而迅速进入肝脏。在肝细胞内经916d从裂殖子（merozoite）发育为成熟的裂殖体（schizont）。当被寄生的肝细胞破裂时，释放出大量裂殖子。它们很快进入血液循环，侵犯红细胞，开始红细胞内的无性繁殖周期。裂殖子侵入红细胞后发育为早
7、期滋养体，即环状体（ring form），经滋养体（trophozoite）发育为成熟的裂殖体。裂殖体内含数个至数十个裂殖子，当被寄生的红细胞破裂时，释放出裂殖子及代谢产物，引起临床上典型的疟疾发作。释放的裂殖子再侵犯未被感染的红细胞，重新开始新一轮的无性繁殖，形成临床上周期性发作。间日疟及卵形疟于红细胞内的发育周期约为48小时。三日疟约为72小时。恶性疟的发育周期为3648小时，且发育先后不一，故临床发作亦不规则。间日疟和卵形疟既有速发型子孢子（tachysporozoite），又有迟发型子孢子（bradysporozoite）。速发型子孢子在肝细胞内的发育较快，只需经1220天就能发育为成
8、熟的裂殖体。迟发型子孢子则发育较缓慢，需经611个月才能发育为成熟的裂殖体。迟发型子孢子亦叫休眠子（hypnozoite），是间日疟与卵形疟复发的根源。1980年Krotoski首先发现肝细胞内有休眠子，其大小为2.97.0m，胞膜较厚，单核，胞质较淡，有泡状物。三日疟和恶性疟无迟发型子孢子，故无复发。部分疟原虫裂殖子在红细胞内经36代增殖后发育为雌性配子体（female gametocyte）与雄性配子体（male gametocyte）。配子体在人体内的存活时间为3060天。（二）按蚊体内阶段疟原虫在按蚊体内的交合、繁殖阶段为有性繁殖期。当雌性按蚊吸血时，配子体被吸入其体内，开始其有性繁殖
9、期。雌、雄配子体在蚊体内分别发育为雌、雄配子（gamete），两者结合后形成合子（zygote），发育后成为动合子（ookinete），侵入按蚊的肠壁发育为囊合子（oocyst）。每个囊合子中含有数千个孢子母细胞（sporoblast），发育后形成具感染能力的子孢子。这些子孢子可主动地移行于按蚊的唾液腺中，当按蚊再次叮人吸血时，子孢子就进入人体，并继续其无性繁殖周期。三、 疟疾的实验室诊断血液的厚、薄涂片经Giemsa（吉姆萨）染色后用显微镜油镜检查，寻找疟原虫，对疟疾的诊断有重要意义。厚血膜（thick film）涂片待干后作吉姆萨染色，红细胞可在染色中被破裂，镜检时仅可见白细胞、血小板和疟
10、原虫。其检出率可比薄血膜（thin film）涂片提高10倍以上，但较难确定疟原虫的种类，最好能与先用甲醇固定再作吉姆萨染色的薄血膜涂片同时作参照检查。恶性疟患者的疟原虫密度常较高，在一个红细胞内常同时有一个以上的恶性疟原虫寄生。于寒战早期病人的血液涂片（blood smear）中，较常发现环状体。发作数日后可发现配子体。间日疟原虫的环状体、大滋养体和裂殖体都较恶性疟原虫大，而且红细胞胀大、疟色素较明显。骨髓涂片的阳性率稍高于外周血液涂片。疟疾的其他实验室诊断方法包括：吖啶橙荧光染色法，具有检出速度较快、检出率较高的优点，但亦有需用荧光显微镜检查的缺点。检测特异性DNA的聚合酶链反应（PCR）
11、，灵敏度高，可达每毫升血液中含10个以上疟原虫的水平。可用免疫学方法，如酶联免疫吸附试验（ ELISA）、放射免疫测定（ RIA）等，检测血液中疟原虫的特异性抗原与特异性抗体，具有方便、快速、敏感的特点。鉴于患者常于感染后34周才有特异性抗体出现，因而特异性抗体的检测价值较小，仅用于作本病的流行病学调查。四、 疟原虫的血涂片镜检法1. 清洗和准备玻片，购买的优质显微镜玻片必须经过以下清洗和处理方可使用：（1） 将玻片取出分散放入去垢剂溶液中，浸泡48小时，或者过夜。（2） 用清洗布或海绵清洗玻片的每一面。（3） 用净水冲洗每块玻片洗去去垢剂。（4） 待玻片沥干后，放入装有酒精的广口瓶内，旋紧盖
12、子，避光保存。（5） 需要时，取出玻片，用清洁的无绒棉布擦干，记住始终只捏玻片的边缘。（6） 这时玻片就可以使用了，它不需要再包装了。2. 试剂准备（1）2%酸性pH校准液：称取2g磷酸二氢钾，溶解于100ml水中（2）2%碱性pH校准液：称取2g磷酸氢二钠，溶解于100ml水中（3）缓冲水：称取0.7g磷酸二氢钾，溶解于150ml水中，再称取1g磷酸氢二钠，溶解于150ml水中，混合两液并加水至1000ml，用精密pH试纸或pH计测量pH，再用2%的酸性和碱性校准液校准至pH7.2。（4）Giemsa染液（有现成市售的，也可用Giemsa染料粉按说明书配制）（5）甲醇3. 采血和制片采集和处
13、理血液标本时必须戴防护手套，避免手指和手掌碰到血液（包括血片上的干血迹）。用防水创口贴覆盖您手上的创口或划痕，在处理已沾血液的锐器时应避免不慎扎到自己。工作完毕务必彻底清洗双手，若不慎将患者血液沾到自己的皮肤上，应立即用酒精棉签擦去，并尽快用肥皂和水清洗污处。污染了血液的材料（诸如刀片、破玻片和棉签必须弃于锐器箱或建立安全可行焚毁程序。登记好患者信息，自己戴好乳胶防护手套，握住病人的左手，让其手心朝上，选择无名指（婴儿用大脚趾而非脚后跟，无论大人和小孩都不能用大拇指）握住，用酒精棉签消毒穿刺部位，用力擦去手指上的灰尘和油腻。用清洁棉球擦干，挤动手指根部刺激血液循环，用无菌穿刺针迅速扎一下。用干
14、棉球擦去第一滴血，确认穿刺部位没有残留棉绒。轻轻挤压出一小滴血点于清洁玻片中央（用于推薄血膜），在离此约1cm处再挤2到3大滴血（用于涂厚血膜）。用棉球将穿刺部位的血液擦去。薄血膜涂片：用另一块清洁玻片作为“推片”，以其边缘接触玻片中央的一小滴血，血液沿此边缘扩散，此时坚定地沿着玻片滑动“推片”（保持45角度），此时血液在玻片被均匀分散。厚血膜涂片： 握住玻片边缘，用推片的一角快速涂出平坦的厚血膜，不要扰拌（stir）血液，只要用三到六个快速“笔画”涂出圆形或方形即可，面积相当于直径为1cm的圆。厚血膜应当水平干燥，且要防止灰尘、苍蝇、阳光和过度加热。厚血膜在染色前必须完全干燥，可使用小型电吹
15、风热风快速吹干（也可以在灯或灯泡上小心加热），但应避免过度加热导致“高温固定（heat fix）”而染色不良。在正常情况下，薄血膜很快就会干燥。过去曾将病人信息、采集日期和编号用铅笔写在薄血膜较厚的部分，现在不推荐这样做，而是写在玻片的毛玻璃端，避免笔尖碰到血膜。当厚血膜完全干燥，立即用化验单或登记表包好送实验室，若不马上检验的话，在染色前可放入干燥器内。“推片”上会残留少量血液，所以每个病人采血都用清洁玻片做推片。4. 染色，有两种Giemsa染色法：快速（10%）法和慢速（3%）法。（1）快速法，每次通常同时不超过15张片子一起进行染色，本法是为实验室快速报告设计，因试剂用得多，成本比较高
16、。用沾有甲醇的棉签轻轻“拖”过薄血膜（或直接将有薄血膜部分的玻片浸入甲醇，或在薄血膜上加一小碟甲醇）进行固定，勿让甲醇（及其蒸气）接触厚血膜。按1ml缓冲水（Ph7.2）加巴氏吸管3滴Giemsa（储存）染液的比例（大约为10%）稀释染色液，稀释染液立即混匀后，加于涂有血膜的玻片上（每张玻片大约需要3ml，或倒入放置血膜玻片的染缸内），染色810min后，逐滴加入净水洗去玻片上的染液。待染液洗净后，将玻片置于干燥架上，有血膜的一面朝下（以免沾上灰尘）。（2）慢速法，只是染液更淡些，稀释到3%。染色时间延长到30min或45min。试剂成本就降低了，比较适合大量调查和随访病人的标本。5. 显微镜检查（1）厚血膜： 用油镜观察染色的视野，计数疟原虫的同时计数白细胞数目，用白细胞总数可以估算出疟原虫浓度（疟原虫计数：/微升）。也可用“+”
