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1、棉籽糖水解法制备三氯蔗糖的初步探索*郑建仙 高宪枫 袁尔东（华南理工大学食品与生物工程学院，广州，510640）摘 要 将棉籽糖选择性氯化后，利用半乳糖苷酶水解脱去C-6位上的半乳糖基，即可得到三氯蔗糖。对6,4,1,6-四氯-6,4,1,6-四脱氧棉籽糖（TCR）的酶解过程进行了详细讨论，并初步探讨了棉籽糖的酶法合成。本法工艺简单，产物专一，有很好的发展潜力。关键词 棉籽糖 6,4,1,6-四氯-6,4,1,6-四脱氧棉籽糖（TCR） 水解Abstract After selective chlorination of raffinose, sucralose is formed throu
2、gh hydrolyzing C-6 galactose group in the presence of galactosidases. The enzymatic hydrolysis of 6,4,1,6-tetrachloro-6,4,1,6-tetradeoxy-raffinose (TCR) was discussed in detail. And the enzymatic synthesis of raffinose was studied briefly. This great potentially method has some advantages, such as s
3、imple synthesis route and product concentration.Keywords raffinose 6,4,1,6-tetrachloro-6,4,1,6-tetradeoxy-raffinose (TCR) hydrolysis在目前已有的各种合成三氯蔗糖的方法中，棉籽糖水解法受到人们的关注。虽然从技术和经济方面考虑，这种方法目前离实用阶段尚有一定的距离，却为三氯蔗糖的合成提出了一种新的思路和方法，具有较高的理论研究价值和应用前景。棉籽糖水解法合成三氯蔗糖是以棉籽糖为原料，经选择性氯化后，经-半乳糖苷酶的水解作用除去半乳糖基制得三氯蔗糖1。其中氯化衍生过程与
4、传统的化学方法一致，本文仅对其中的酶法水解部分作详细的研究和探讨。1. 反应原理及步骤如图1所示，棉籽糖可以看作是蔗糖的半乳糖衍生物，是一种三糖分子。由于棉籽糖的半乳糖残基正好位于蔗糖C-6位上，充当着蔗糖C-6位上天然保护基团的角色。因此，若以棉籽糖为原料，对其C-6、4、1、6进行选择性氯化，再水解-1,6-糖苷键除去半乳糖残基，即可得到三氯蔗糖，反应过程如图2所示2。注* 国家自然科学基金资助项目(29906003)图1 棉籽糖的化学结构图2 棉籽糖水解法合成三氯蔗糖的主要步骤除棉籽糖外，蔗糖C-6位羟基已经被糖苷键保护的低聚糖，还包括四棉水苏糖（Stachyose）和五棉毛蕊花糖（Ve
5、rbascose）等，理论上都可以利用它们的这一性质来合成三氯蔗糖。2. TCR的酶法水解由于化学水解缺乏专一性，因此对-1,6-糖苷键的水解需要在特定酶的作用下才能完成。2.1 酶制剂的选择已知具有糖酶活性（如葡聚糖酶、蔗糖酶以及、-半乳糖苷酶等）的50多种商品酶制剂，人们都已进行了水解6,4,1,6-四氯-6,4,1,6-四脱氧半乳棉籽糖（TCR）的-1,6糖苷键的活力测试，但结果并不理想。这些酶制剂包括4种从植物中获得的-半乳糖苷酶，以及7种从细菌和霉菌中获得的-半乳糖苷酶；其中只有一种商品酶制剂，即半纤维素酶对TCR具有活力，但水解速度非常慢。为此，人们转向从微生物中寻找能水解TCR的
6、-半乳糖苷酶。筛选具有水解TCR活力的微生物通常要经过如下三个步骤3：（1）将微生物置于以棉籽糖为唯一碳源的培养基中进行富集培养。（2）用超声波破碎微生物细胞，并以对硝基苯-D-半乳糖苷为底物对微生物进行活力测试。那些确定具有对硝基苯-D-半乳糖苷活性的微生物，再进一步检测其水解棉籽糖为半乳糖和蔗糖的能力。（3）对具有水解棉籽糖活力的微生物再用TCR进行筛选，以确定其水解TCR的-半乳糖苷酶活力。事实上，所有被测试的微生物都能水解棉籽糖，但对TCR具有活性的则非常少，结果如表1所示。表1 酶法水解四氯棉籽糖制备的酶活力比较微生物ATCC序号酶活力（p-NP*）酶活力（TCR*）酶活力的比值（T
7、CR：p-NP）Absidia griseolaAbsidia griseolaAbsidia griseolaAspergillus awamoriA.nigerCircinella muscaeCircinella muscaeCircinella muscaeM.vinaceaM.vinaceaM.vinaceaM.vinaceaSaccharomyces uvarumTalaromyces thermophilus204302043122618447333622016008203942233720034200343419542425423671646135.518.643.720.82
8、0.175.428.911.318.221.38.910.61.61.000.2000.491.120.201.094.31.331.06000.0240.0150.0600.2020.1490.100注 * p-NP是对硝基苯-D-半乳糖苷，此处酶活以p-NP为底物进行测量。* 酶单位以mg三氯蔗糖/g酶制剂/hr表示。显然，具有显著-半乳糖苷酶活力的酶制剂都是从霉菌菌丝体中获得的。在5个具有最强的水解TCR活力的霉菌中，有4个是从M.Vinacea中获得的，有1个是从C.Muscae中获得的。其中M.Vinacea ATCC 20034在所有被测试的微生物中，对TCR具有最高的水解能力。从
9、该微生物中提取的-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.22）不含转化酶的活力，目前已在甜菜糖精炼中被用来水解棉籽糖4。它还可以被固定化，此时对TCR则有更强的水解能力。-半乳糖苷酶水解TCR的速率通常要比水解棉籽糖慢50100倍左右。产物抑制是一个可能的原因，因为-半乳糖苷酶常常会受到半乳糖的抑制。另一个原因可能是，由于自由的C-6位羟基对底物与酶活性部位的高效结合是必需的。酶活力降低的原因还可能是由于，位于糖苷键附近的4-Cl会阻碍酶的水解作用。2.2 TCR溶剂的选择由于TCR在水中的最大溶解度仅为15%，使得棉籽糖酶解法合成三氯蔗糖在经济上受到限制。因此，必须首先找到一种合适的TCR溶剂，要求
10、它既能较大限度地溶解TCR，又能保证-半乳糖苷酶的活力。已知TCR只有在亲水的溶剂中才能高度溶解，但在保证酶解反应能得到必要的水的前提下，-半乳糖苷酶却被证明在与水不互溶的有机溶剂中最稳定并具有最高的活力。这个矛盾可以通过使用被含水缓冲液预饱和的有机溶液而得以解决。研究发现，高水混溶的溶剂如二氧六环、丙酮、甲醇和四氢呋喃等即使使用高达30%的含水缓冲液进行预饱和，也不支持-半乳糖苷酶的水解反应。但在含水缓冲液预饱和的正丁醇、甲基异丁基酮和乙酸乙酯三种溶液中，TCR的溶解度均达到50%以上，这些溶剂同时也支持-半乳糖苷酶的活力，只是三者对三氯蔗糖的溶解性存在很大的差别，如表2所示。表2 TCR和
11、三氯蔗糖在各种溶剂中的溶解度单位：%溶 剂 *TCR三氯蔗糖水正丁醇甲基异丁基酮乙酸乙酯正辛醇硝基苯1550505055065.711 注 *各种有机溶剂在55用含水缓冲液预饱和利用从M.Vinacea ATCC 20034中分离出的-半乳糖苷酶，在上述三种有机溶剂中将TCR水解为6-氯半乳糖和三氯蔗糖的反应过程，如图3所示。虽然在甲基异丁基酮中，-半乳糖苷酶水解TCR的反应速率达到了水相反应的90%，但在每种溶剂中起始反应速率和最终产物浓度都比在水溶液中低。低反应速率是由于在溶剂系统中，-半乳糖苷酶有更高的Km，而非一个更低的Kcat。因此在有机溶剂中，要获得和水相反应相似的反应速率，只能通
12、过高底物浓度来实现，但酶的活力因溶剂影响而快速降低。在所测试的溶剂中，酶的半衰期都不超过3天。当TCR的水解度超过60%时，反应速率明显降低，因此要获得超过80%的水解度就显得非常困难，必须使用很高的酶浓度并大大延长保温时间（数天）。目前为止，还没有一种-半乳糖苷酶能达到90%以上的水解度。图3 各种有机溶剂对TCR转化成三氯蔗糖的影响Christopher Bennett等人曾对从M.Vinacea和A.niger中获得的-半乳糖苷酶，进行提高水解反应速度的试验，包括使用表面活性剂、增加离子强度和提高反应温度等。前两种方法均不成功，但发现当pH为5.05.5、反应温度为55时，酶的失活和反应
13、速率处于最佳平衡状态。此时，从M.Vinacea中获得的-半乳糖苷酶，对TCR水解反应的Km=5.8mmol/L，最高速率Vmax=118mmol三氯蔗糖/g干酶h。3. 棉籽糖的酶法合成尽管棉籽糖在甜菜、棉花等多种植物中广泛存在，但到目前为止仍未实现工业化生产，无法满足三氯蔗糖生产对原料棉籽糖的需求。为此，Tate & Lyle公司就棉籽糖的酶法合成进行了深入研究后发现，棉籽糖可以通过A.niger -半乳糖苷酶在30催化近饱和的半乳糖和蔗糖溶液来合成，起始反应速率为145mg棉籽糖/g酶制剂h，最终棉籽糖得率约为8.9%。研究发现，通过增加底物半乳糖含量可以提高棉籽糖得率。曾有人尝试通过将
14、反应体系逐渐浓缩使棉籽糖从溶液中结晶出来，进而使反应向合成棉籽糖的方向进行以提高棉籽糖得率。结果虽然得到棉籽糖的结晶沉淀，但结晶物中却同时含有大量的葡萄糖。此外，棉籽糖也可以通过使用A.niger-半乳糖苷酶先从葡萄糖合成蜜二糖，再使用果糖转移酶将蔗糖的果糖单元转移到蜜二糖分子上以最终合成5。而其它-半乳糖苷酶以及具有-1,6糖苷键活力的酶，如葡萄糖化酶或葡聚糖酶等，却不能合成棉籽糖。4. 前景展望棉籽糖水解法制备三氯蔗糖的工艺简单，可操作性强，也不存在色谱分离方面的问题。而且，反应过程中所使用的-半乳糖苷酶，可以很经济地获得并以固定化的形式使用。同时，三氯蔗糖还可以从反应溶剂中被选择性地结晶出来，从而使反应向正方向进行并减少回收成本。因此，棉籽糖水解法具有很好的研究开发价值和广阔的应用潜力。尽管如此，利用棉籽糖水解法生产三氯蔗糖所面临的最大困难就是，如何解决棉籽糖的来源问题。目前，棉籽糖仍未实现工业化生产，它必须从天然糖源如甜菜糖蜜或棉籽粉中分离出来，或经过-半乳糖苷酶从半乳糖和蔗糖中合成而得，根本无法满足工业化生产三氯蔗糖对原料棉籽糖的需求。另外，还有一个突出的问题，就是TCR的酶解速度很慢，特别是要达到60%70%以上的水解率就需要更长的时间。参考文献1 郑建仙主编，低能量食品，北京：中国轻工业出版社，20012 Christopher Bennett et a
