DNA转化实验报告

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1、DNA 转化实验报告2009 级生物学基地班 李晓芬 2011.9.22【摘要】DNA 转化是将外源 DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手 段。本实验以E.coli DH5A菌株为受体细胞，并用CaCl处理，使其处于感受态，2然后与pUC-19质粒共保温，实现转化。由于pUC-19质粒带有氨苄青霉素抗性基 因(Ampr )，可通过在培养基中加入氨苄青霉素，利用Amp抗性来筛选转化子。 同时，蓝白斑法对能够产生P -半乳糖苷酶的转化子进行筛选，最终成功得到了 预期的实验组蓝色菌落、对照组无任何菌落的结果。In molecular biology ， transformation

2、 is the genetic alteration of acellresultingfromthedirectuptake，incorporationandexpressionof exogenousgeneticmaterial(exogenousDNA)fromitssurroundingandtaken up through the cell membrane(s) . DH5A isusedtoselecttherecombinant DNA using the activity of 0 -galactosidase (a -complementation) recovered

3、with lacZa pep tide of the vec tor DNA and lacZ M15 coded in F episome in this strain. This strain carries F episome and it is useful for the preparation of ssDNA as well as gene library construction and subcloning.【关键词】DNA转化、CaCl法、大肠杆菌、质粒、氨苄青霉素抗性、蓝白斑筛2选一、实验目的掌握CaCl法将载体(质粒)转化入受体(大肠杆菌)的实验技术。2二、实验原理1、

4、转化：在自然条件下， 很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内， 但 在人工构建的质粒载体中， 一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因， 因此不能自行 完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需 诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。转化即是将外源DNA分子 引入受体细胞， 使之获得新的遗传性状的一种手段， 它是微生物遗传、分子遗传、 基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性 内切酶和甲基化酶的突变体(R_,M_),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳 定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方

5、法(如电击法,CaCl ,RbCl、KCl等化2学试剂法)的处理后, 细胞膜的通透性发生了暂时性的改变, 成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制, 表达实现遗传信息 的转移, 使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培 养，即可筛选出转化子(带有异源DNA分子的受体细胞)。本实验中，采用较为简便易行的感受态细胞获得办法 CaCl 法，用蓝白斑筛选法筛选转化子。2、载体pUC-19质粒带有氨苄青霉素抗性基因，而宿主菌DH5A对氨苄青霉素没 有抗性。在用pUC-19质粒转化DH5A后，涂布到含有氨苄青霉素的培养基上培 养，没有被转化的

6、菌不能生长，而被转化了的菌可以正常生长，形成菌落。3、a -互补：pUC-19质粒带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有0 -半乳糖 苷酶基因（LacZ）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。DH5A宿主菌染 色体上带有 Lac Z 的 C 端部分编码信息，它们编码的肽段各自都不具有酶活性， 但它们在同一细胞内可以通过非共价键结合起来， 形成具有0 -半乳糖苷酶活性 的蛋白质。质粒载体与 LacZ 基因上缺失近操纵基因区段的 0 -半乳糖苷酶阴性 的大肠杆菌突变体之间的这种互补作用就称为 a -互补。4、如图一，IPTG是0 -半乳 糖苷酶的活性诱导物质。基于这个特 性，当pUC系列的载体

7、DNA （或其他 带有lacZ基因载体DNA）以lacZ缺 失细胞为宿主进行转化时，如果在平 板培养基中加入X -Gal和IPTG,由 于0 -半乳糖苷酶的a -互补性， 可以根据是否呈现白色菌落而方便 地挑选出基因重组体。此外，它还可 以作为具有 lac 或 tac 等启动子的表 达载体的表达诱导物使用。如图二，只有成功进行了载体与受体 a -互补之后的细菌，才能产生具有 0 -半乳糖苷酶活性的蛋白质，将乳糖 转化为半乳糖和葡萄糖，即使底物 X-gal 水解变为蓝色；而未能将质粒 DNA 成功 导入的细菌则不能形成0 -半乳糖苷酶，实现了蓝白斑筛选。调节基因操纵基因启动子_0结构基因lacl

8、七5 /与操纵 皿亍人/因结合, 场冷止Z.Y.A一一j_flac Zlac Ylac AJJL小1mRNA （多顺反子）基因的转录一半乳糖昔酶透性酶乙酰基转移酶 阻遏蛋白jlPTGX-gal乳糖阻遏蛋白TPTG复合体蓝色半乳糖+葡萄糖图二三、实验材料1、试剂药品准备：蛋白胨、酵母粉、NaCl、琼脂、NaOH、异丙基-0 -D-硫代半乳 糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-0 -D-硫代半乳糖苷（X-gal ）、O.lmol/L CaCl?、 氨苄青霉素LB固体培养基（80mL） =0.8g蛋白胨+0.4g酵母粉+0.8gNaCl+1.2g琼脂 （1.5%） +80mL 蒸馏水，NaO

9、H 调 pH 至 7.02、仪器：高压灭菌锅、恒温培养箱、台式离心机、超净工作台、恒温水浴锅3、其他：大肠杆菌DH5A （受体）、质粒pUC19 Vector （载体）四、实验步骤1、制备感受态细胞制作选择平板：按配方配制好LB固体培养基后，高压灭菌并冷却到50 C。 加入氨苄青霉素母液（500mg/mL） 9.6卩L,使其终浓度为60p g/mL，倒两个平板。 在超净工作台上，分别在两个平板的培养基表面涂布40p LX-gal和8p LIPTG 溶液，室温下放置34小时。将培养好的20mL大肠杆菌DH5A转移到一个无菌离心管中，冰上静止放置 10分钟，是培养物冷却到0 C。以4000r/mi

10、n离心10分钟，回收细胞，弃上清，将管倒置使残留的痕量培 养液尽量流尽；以1.5ml冰冷的0.1mol/L CaCl悬浮沉淀。2以2000r / min离心10分钟，回收细胞且使培养液流尽。取1ml冰冷的0.1mol/L CaCl?悬浮细胞，将细胞分成200L 一份，装入 Eppendorf 管中，此时的细胞为感受态细胞。2、细胞转化取2管200L的感受态细胞，1管中加入2p L的pUC-19 DNA，另1管为 不加质粒DNA的对照，轻轻旋转以混匀内容物，冰上放置30分钟。热激反应：将管放到42C水浴中1.5分钟，不要摇，然后在冰浴中迅速冷 却 2 分钟。每管加入100L的LB培养基，37C水

11、浴中温育45分钟。3、培养从转化管和对照管中各取 200 L 菌液加在两个含有氨苄青霉素及 XGal 和 IPTG 的选择平板培养基上，用一无菌涂布棒轻轻将细菌涂在琼脂平板表面， 将平板置于室温约1小时，直至液体被吸收。倒置平皿37C培养17h。第二天上午观察结果，记录现象，并大致估计各皿的菌落数。五、结果与讨论1、实验结果如图三可以看到，实验组中长出蓝色菌落，对照组中无任何菌落生长，与预期结果 相同。说明载体pUC-19质粒已成功通过CaCl法导入受体大肠杆菌DH5A中，2完成了a -互补之后将X-gal水解为蓝色物质；而未进行转化的对照组中，原大 肠杆菌对氨苄青霉素没有抗性，在含有氨苄青霉

12、素的培养基中不能生长。由于菌液浓度过大，且接种时涂布不均匀，实验组中得菌落连接成片，难以计数，不能根据公式转化频率=转化子总数质絞DNrX加人量（mgj进步计算转化率。2、为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从 70C或-20T甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生 长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的 OD600 来控制，密度 过高或不足均会影响转化效率。质粒的品质和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA（cccDNA）。 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的

13、外源DNA的量过多 或体积过大时，转化效率就会降低。Ing的cccDNA即可使50l的感受态细胞达 到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%（本实验中 为 1%） 。试剂的品质：所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的，最好分装保存于 干燥的冷暗处。防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器 皿， 如离心管等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防 止被其它试剂、NA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。3、由于涂布X-gal和IPTG时，培养基在超净工作台上酒精灯附近

14、放置时间过长, 稍有熔化，所以造成破损，对结果观察有一定影响。CINCI图四2卩-GalactosidaseX-Gal4、涂布 X-gal 时要注意速度，时间长可能失活，变性后则不能得到预期的蓝色 菌落结果。如图四，X-Gal是P -半乳糖苷酶的底物，水解后呈蓝色。基于这 个特点，pUC系列载体DNA （或其他带有lacZ基因载体DNA）以lacZ缺失细胞 为宿主进行转化时，如果在平板培养基中加入X -Gal和IPTG,由于p -半乳糖 苷酶的a -互补性，可以根据是否呈现白色菌落而方便地挑选出基因重组体。5、LB固体培养基：LB 一般被解释为Luria-Bertani培养基，其发明人为贝尔塔

15、 尼（Giuseppe Ber tani）,这个名字来源于英语的lysogeny bro th,速溶菌肉汤。 LB 培养基是一种培养基的名称,生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种, 使菌种成倍扩增,达到使用要求。培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境 单独存活和扩增的工程菌。通过培养工程菌,我们可以表达大量的外源蛋白,也可 以拿到带有外源基因的质粒,工程菌的有效扩增是生化分子实验的基础。六、思考题1、对照中如果出现菌落会是哪些原因?如果对照中出现菌落，可能的原因有以下几点：没有在培养基中加入氨苄青霉素，使得具有抗性（已进行转化的实验组） 和不具有抗性（为转化的对照组）都能够在 LB 培养基上生长；接种时已接种过实验组的工具被污染，未彻底灭菌后又接种对照组，具有 氨苄青霉素抗性的转化子在对照组培养基上生长，出现菌落；所以为避免这种情 况，应在接种时先进行对照组，便不会被污染。2、实验组菌落没有转蓝是什么原因？X-gal 未被加入培养基或由