《显微操作在脐血干细胞移植修复大鼠脊髓损伤中的应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《显微操作在脐血干细胞移植修复大鼠脊髓损伤中的应用（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、显微操作在脐血干细胞移植修复大鼠脊髓损伤中的应用尹文化，金大地，鲁凯伍，闫慧博，王璐，邓许勇【摘要】目的建立大鼠脊髓全横断损伤模型，应用显微操作方法和人脐血干细胞移植修复大鼠脊髓损伤，观察显微操作技术对大鼠受损脊髓功能恢复的影响。方法取足月安康顺产新生儿脐血，别离、培养脐血干细胞。60只SD雌性大鼠，随机分为假手术对照组A组，n=10、实验对照组B组，n10、常规治疗组组，n=20和显微治疗组D组，n=20。A组大鼠只翻开椎板；B、组大鼠采用常规方法行T89平面脊髓全横断，造成急性脊髓损伤，组大鼠于脊髓两断端用1l注射器分别注射脐血干细胞悬液1l干细胞浓度为6109/L7109/L，B组同法注
2、射等量PBS液；D组采用显微操作技术行脊髓横断，并以口径50的毛细玻璃针用一样方法注射脐血干细胞。术后18周内每周进展1次后肢BBB评分，术后第8周处死大鼠，比照观察术中和术后第8周各组大鼠脊髓大体标本外形、颜色、质地和体积大小改变。结果A组大鼠手术前后运动功能、脊髓大体标本未见明显变化。B、D组大鼠术后双侧后肢完全性瘫痪，B组大鼠无明显恢复。而、D组大鼠，从术后第2周开场逐渐恢复部分后肢运动功能。第3周以后，D组大鼠后肢运动功能BBB评清楚显优于组，具有显著性差异P0.05。术后第8周，所有大鼠脊髓横断处均瘢痕愈合，B组大鼠远侧段脊髓干瘪、皱缩；组大鼠远侧段脊髓直径轻度变细，外形尚饱满；D组
3、大鼠横断处两侧脊髓直径无明显差异，外形圆润，但部分可见明显瘢痕粘连。结论人脐血干细胞移植对脊髓横断性损伤具有较好的治疗作用，显微操作技术的应用能最大可能地减少人为造成的脊髓损伤，有利于脊髓损伤的功能修复。【关键词】显微操作；脊髓损伤；脐血干细胞；移植Keyrds：iranipulatin;spinalrdinjury;ubilialrdbldsteells;transplantatin脊髓损伤spinalrdinjury,SI严重影响患者的生活质量，促进SI后脊髓神经和轴突再生，在一定程度上恢复双下肢感觉和运动功能，一直是医学界努力的方向。多种干细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究已获得一定进展，但
4、疗效尚不理想，除却进一步探究更理想的种子细胞，操作方法的选择也是影响疗效的一个重要因素。人脐血干细胞来源广泛，具有分化成包括神经细胞在内的多种组织细胞的潜能1、2，有望成为脊髓再生研究中移植细胞的良好替代品，具有较好的应用前景。本实验建立了大鼠完全性脊髓横断模型，并对采用不同操作方法治疗大鼠脊髓损伤后神经功能的恢复和脊髓大体形态学变化进展了比照研究。1材料与方法1.2实验动物与分组雌性SD大鼠由南方医科大学实验动物中心提供答应证号SXK(粤)202200152022B023。随机挑选60只成年雌性安康SD大鼠，体重230270g，平均2366.78g，随机分成4组，其中A组n=10只翻开椎板，
5、为假手术对照组；B组n=10行完全性脊髓横断PBS断端注射；组(n=20)行完全性脊髓横断脐血干细胞移植，D组(n=20)在显微操作下行完全性脊髓横断脐血干细胞移植。对死亡大鼠模型，分析死亡原因，并及时予以补足。1.3大鼠脊髓全横断模型的建立和人脐血干细胞移植大鼠用100g/L水合氯醛300g/kg腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于手术台上，无菌条件下以T9椎体棘突为中心，纵行切开约2，钝性别离棘突两侧椎旁肌达椎板外表，微型自动牵开器牵开两侧椎旁肌，暴露椎板和椎体棘突，咬除T810椎体棘突。微型神经剥离子钝性别离T810椎间黄韧带，微型枪钳咬除T8、9椎板至两侧关节突内缘。纵行剖开硬脊膜约0.5，经
6、硬脊膜切口，于硬脊膜下蛛网膜外，将超薄手术刀片抵在一侧骨壁上，划断脊髓，包括脊髓背静脉、两侧的脊髓背动脉和脊髓腹动脉，防止反复切割。选择安康足月产妇，待新生儿娩出后，按照ang等3的方法备取第3代脐血干细胞，在立体定位仪下用1l微量注射器行细胞移植。D组大鼠采用毛细玻璃针行细胞移植，其硬脊膜切口采用显微缝合。其余各组大鼠背侧硬脊膜切口用胸背部筋膜片覆盖，常规分层缝合。术后连续3d每日予青霉素3万IU/kg肌注1次。每笼饲养45只大鼠，恒温保暖，隔日更换垫料。每日行人工膀胱按摩排尿，早晚各1次。D组显微操作在10倍手术显微镜下完成。1.4脊髓形态学观察及后肢运动功能评价术中观察各组大鼠脊髓形态构
7、造变化。从术后第1周开场，对大鼠进展BBB评分4，每周1次，每次持续观察4in或来回爬行5个轮回，取平均分，直至术后8周。没有额外的引诱或促动因素。评分者为非本组实验人员且熟知BBB评分标准。术后第8周，过量麻醉处死大鼠，经心脏灌注固定脊髓，观察其形态、颜色、质地、体积大小及部分粘连情况，并与术中情况进展比照。2结果2.1人脐血干细胞别离、体外培养及免疫鉴定共采集36份新颖脐血，每份脐血平均采集量为25.94l(2089l),脐血干细胞别离后，用苔盼蓝拒染法测定细胞活力。lypus相差显微镜观察细胞并计数，可见少许死亡细胞呈深蓝色，绝大多数细胞拒染，呈亮堂圆球状，活细胞百分比为98%0.71%
8、。细胞计数板计数，别离后每份脐血干细胞计数为1.450.14109/L。按ang等3的方法体外纯化培养脐血干细胞，取第3代脐血干细胞，用流式细胞仪检测细胞外表抗原结果说明，人脐血干细胞不表达或弱表达D34、D45、D106等造血干细胞和内皮细胞标志，但是显著高表达D29、D105等间充质干细胞外表抗原标志。2.2大鼠术后情况及后肢运动功能评价A组大鼠术后全部存活，术前、术后BBB评分无明显变化。B、D组大鼠术后均表现为双侧后肢完全性缓慢性瘫痪，B、组大鼠分别死亡2、3例均因术后尿道梗阻致膀胱破裂，D组死亡2例其中1例为术后第9d因大便梗阻致死；另1例为尿道寄生虫梗阻，膀胱破裂致死，B、D组死亡
9、率分别为20、15、10%。并发单侧后肢褥疮3例B组2例，D组1例，并发单侧下腹部褥疮2例、D组各1例，经积极创面护理后愈合。术后第2周，、D组大鼠逐渐恢复部分后肢运动功能，D组大鼠后肢开场出现关节活动，并逐步出现下肢无承重划动、足背承重。从术后第3周开场，D组大鼠后肢运动功能恢复较快，BBB评清楚显优于组，开场出现后肢部分承重，并且后肢爪的功能出现不同程度的恢复，差异具有显著性意义P0.05。术后56周，、D组大鼠后肢功能恢复进入平台期表1。表1术后各组大鼠后肢神经功能BBB评分结果比拟D组与组比拟，*P0.05；*P0.012.3大鼠术中和术后第8周脊髓形态学观察A组大鼠硬脊膜完好，术中与
10、术后相比脊髓未见明显变化，仅见硬脊膜与周围组织轻度粘连。D组采用显微操作，术中脊髓背静脉明晰可见图1b，硬脊膜保存完好图2，行脊髓横断和脐血干细胞移植后两断端光整，外形饱满，术野明晰图2d；而B组和组未采用显微操作，术中可见脊髓背静脉和硬脊膜毛细血管充血明显图1a。行脊髓横断后，B、两组分别行PBS注射和脐血干细胞移植，术中可见横断处两侧脊髓部分塌陷、水肿、变形，脊髓残端参差不齐，部分大鼠可见脊髓组织水肿、膨出图2a、2b。术后第8周，所有实验大鼠脊髓横断处均瘢痕愈合，部分与周围组织粘连，以D组更为显著，别离困难；B组大鼠横断处远侧段脊髓明显萎缩、干瘪，直径变细图3a；组大鼠横断处远侧段脊髓直
11、径稍变细，但外形尚圆润、饱满(图3b)；D组横断处瘢痕增生范围最窄，两侧脊髓直径、外形、色泽无明显差异图3。3讨论干细胞移植治疗脊髓损伤作为一种新的生物治疗手段，可以在一定程度上直接为病灶区补充神经元和神经间质细胞，促进残存神经细胞和轴突的存活与再生5，因此受到越来越多的关注。但是，目前已研究的干细胞，例如骨髓间充质干细胞、神经干细胞、胚胎干细胞、脂肪干细胞等5、6，或因为取材来源受限，或存在伦理学等问题，使相关根底研究和临床应用受到限制。人脐血来源丰富，研究说明，在不同实验条件下，人脐血干细胞具有向包括神经细胞在内的各胚层细胞分化的潜能1、2，加之取材平安，操作简单，容易被孕妇及其家属所承受
12、，无伦理学等问题，有望成为神经再生研究中移植干细胞的良好替代品7、8。作为中枢神经系统的常见病和多发病，脊髓损伤SI的治疗目前仍限于保守支持治疗，虽然有应用干细胞治疗脊髓损伤的相关研究报道，但是效果尚不理想，其中存在的问题之一就是目前实验研究均未能有效打破神经再生的主要屏障胶质瘢痕9。已有的SI模型包括脊髓半切模型、全横断模型或脊髓打击模型等10，由于造模方法和操作的差异，难以对影响胶质瘢痕形成的原因、以及脊髓神经和轴突再生通过胶质瘢痕的才能进展量化评估，造成对治疗效果的评估困难。针对该问题，本实验对造模方法进展了一些改良：采用显微操作技术，在保证脊髓全横断的前提下，尽可能的减少操作中人为造成
13、的对脊髓残端及残存神经纤维的损伤，从而尽可能的减轻神经胶质瘢痕的形成和缩小胶质瘢痕的厚度，为神经纤维和轴突再生通过胶质瘢痕区创造条件。本实验组观察发现，在人脐血干细胞移植后的、D组中，D组由于采用了显微操作技术，术中操作精细，对硬脊膜和脊髓的干扰和损伤少，术中脊髓背静脉明晰可见，构造清楚，硬脊膜保存完好；而未采用显微操作的组，那么可见脊髓背静脉和硬脊膜毛细血管网明显充血、扩张。同样，行脐血干细胞移植后，采用显微操作技术的D组脊髓两端齐整，横断间隙均匀，术野明晰，脊髓残端外形饱满、轮廓清楚；而组脊髓残端那么明显水肿、膨隆，部分横断间隙被膨出的脊髓组织所充填。在术后第8周，D组脊髓标本外形饱满，色
14、泽乳白，直径均匀，横断处瘢痕组织增生非常局限；与此形成鲜明对照的是，组脊髓标本可见长段瘢痕增生区，部分脊髓外表粗糙、外形粗细不均，而且远侧段脊髓直径也有所变细。由此可见，显微操作技术的应用，不但减少了操作过程中不可防止的对脊髓的人为损伤，而且减轻了胶质瘢痕的形成和胶质瘢痕的厚度。与此相一致，从术后第3周开场，虽然、D组大鼠双侧后肢运动功能均逐步恢复，但是D组大鼠恢复的速度和程度明显优于组，具有统计学意义P0.05。这说明显微操作技术的应用，为神经和轴突再生通过脊髓损伤区创造了条件，从而可以在一定程度上促进和进步脊髓神经功能的恢复，进步了治疗效果。研究说明7，将人脐血干细胞植入大鼠脑内，移植细胞
15、可以分化为神经胶质细胞和神经元。illing等8将人脐血干细胞移植入成年大鼠局灶性脑缺血灶内24h后，观察到成年大鼠记忆功能的改善。在本实验中，与采用人脐血干细胞移植治疗的、D两组相比，虽然B组术中所见与脐血干细胞移植治疗的组相似，但是，术后B组大鼠双侧后肢运动功能始终未见恢复，而且术后第8周，B组大鼠脊髓标本横断处两侧直径差异显著，远侧段脊髓明显萎缩、干瘪，直径变细，外形轮廓不规那么。这说明，脐血干细胞移植对脊髓损伤有较好的治疗作用，但是其详细作用机制目前尚不完全清楚，有待进一步深化研究。图1a普通操作致脊髓背静脉和硬脊膜毛细血管网明显充血、扩张图1b采用显微操作的D组，脊髓背静脉明晰可见，硬脊膜毛细血管无充血图2aB组大鼠脊髓横断+PBS残端注射后，横断处被水肿、膨出的残端脊髓组织充填图2b组行脊髓横断+脐血干细胞移植后，横断处两侧部分脊髓塌陷图2、2dD组采用显微操作行脊髓横断+脐血干细胞移植后，硬脊膜保存完好，脊髓残端整齐、构造清楚，横断间隙均匀图3术后第8周脊髓大体形态学比拟图3aB组大鼠脊髓横断处毁损严重，部分可见长段瘢痕组织增生，远侧段脊髓明显萎缩外形干瘪,直径变细图3b组大鼠脊髓横断处亦可见长段瘢痕增生，远侧段脊髓直径稍变细，但外形饱满、圆润图3D组大鼠脊髓横断处局限性瘢痕组织增生，横断处两侧脊髓直径，外形无明显差异综上所
