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1、农杆菌质粒载体系统质粒载体系统中最常用的质粒有：Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒存在于根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）中，Ri质粒存在于发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenis）中。Ti质粒和Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处，具有基本一致的特性。但实际工作中，绝大部分采用Ti质粒。农杆菌质粒是一种能实现DNA转移和整合的天然系统。Ti质粒有两个区域：T-DNA区（是质粒上能够转移整合入植物受体基因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘿瘤的发生，且可通过减数分裂传递给子代的区域）和Vir区（编码能够实现T-DNA转移的蛋白）。T-DNA长度为12-24
2、kb之间，两端各有一个含25bp重复序列的边界序列，在整合过程中左右边界序列之间的T-DNA可以转移并整合到宿主细胞基因组中，研究发现只有边界序列对DNA的转移是必需的，而边界序列之间的T-DNA并不参与转化过程，因而可以用外源基因将其替换。Vir区位于T-DNA以外的一个35kb内，其产物对T-DNA的转移及整合必不可少。农杆菌侵染植物首先是吸附于植物表面伤口，受伤植物分泌的酚类小分子化合物可以诱导Vir基因的表达。Vir产物能诱导Ti质粒产生一条新的T-DNA单链分子。此单链分子从Ti质粒上脱离后，可以与Vir产物VIRD2蛋白共价结合，并在VIRD4和VIRB等蛋白的帮助下从农杆菌进入植
3、物细胞的染色体中。由于野生型Ti质粒过于庞大，约200-800kb，为了便于重组DNA操作，研究人员对Ti质粒进行了改造从而构建一系列合适的Ti衍生载体。首先除掉了野生型Ti质粒T-DNA区的一段DNA片段。例如：参与植物生长素和细胞分裂素的基因（这些基因过度表达植物激素，从而破坏受体细胞和激素产量)。此外需在Ti质粒上加上E.coli复制起始位点，使得插入外源基因的Ti质粒在为一个穿梭载体，不但可在农杆菌中复制，而且便于在E.coli中重组操作与保存。植物转化载体系统(包括一元载体系统和双元载体系统)。人们在研究中发现在T-DNA转移过程中，Vir基因并不一定与T-DNA位于同一个质粒上，于
4、是通过构建中间载体解决了Ti质粒不能直接导入目的基因的困难。大肠杆菌具有能与农杆菌高度接合转移的特性，因此研究者可以将T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外源基因，最后通过接合转移把上源基因引入到农杆菌的Ti质粒上。这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T-DNA引入Ti质粒的有效方法。带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒的衍生载体称为中间载体”(intermediatevector)，而接受中间载体的Ti质粒则称为受体Ti质粒(acceptorTiplasmid)，一般是卸甲载体(disarmedvector)。所谓卸甲载体就无毒Ti质粒载体。因为利用野生型的Ti质粒作载体时影响植
5、株再生的直接原因是T-DNA中onc基因的致瘤作用。因此为了使野生型的Ti质粒成为基因转化的载体，必须切除T-DNA的onc基因，而“解除”其“武装”，构建成所谓的“卸甲”或称“缴械”载体。在这种onc-载体中已经缺失的T-DNA部分被大肠杆菌的一种常用质粒pBR322取代。这样任何适合于克隆在pBR322质粒的外源DNA片段都可以与pBR322质粒DNA同源重组，而被其整合到onc-Ti质粒载体上。中间载体通常是多拷贝的E.coli小质粒，这一点对Ti通过体外操作导入外源基因是非常必要的。从结构特点看可分为两类中间载体：即共整合系统中间载体和双元系统中间载体。根据两类中间载体，目前已开发出两
6、类转化体系：一类是一元载体系统(整合载体系统)，这一类载体系统由一个共整合系统中间表达载体与改造后的受体Ti质粒组成。在农杆菌内，通过同源重组将外源基因整合到修饰过的T-DNA上,形成可穿梭的共整合载体，在Vir基因产物的作用下完成目的基因向植物细胞的转移和整合。但这类方法构建困难，整合体形成率低，一般不常用。另一类转化体系是双元载体系统，它由两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒微型Ti质粒(mini-Tiplasmid)和辅助Ti质粒(helperTiplasmid)构成，T-DNA和Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移到植物细胞基因组内。微型Ti质粒就是
7、含有T-DNA边界但缺失Vir基因的Ti质粒，为一个广谱质粒。它含有一个广泛寄主范围质粒的复制起始位点(OriV)，同时具有选择性标记基因。辅助质粒为含有Vir区段但T-DNA缺失的突变型质粒，完全丧失了致瘤的功能。因此相当于共整合载体系统中的卸甲质粒。其作用是提供Vir基因功能。激活处于反式位置上的T-DNA转移。将微型质位转入到含有辅助性Ti质粒农杆菌的途径有两条：一条是直接用纯化的微型Ti质粒转化速冻的根癌农杆菌感受态细胞；另一条途径是采用三亲交配方法，三亲交配由含微型Ti质粒的E.col、含有助动质粒PRK2013的E.coli和含有辅助Ti质粒的农杆菌组成。三细菌混合后产生菌间的接合
8、转导。pRK2013可移入农杆菌，但由于不能自主复制而被丢失，其进入含有微型Ti质粒的E.coli后，可促进微型Ti质粒一起或分别转移入农杆菌中。但由于pRK2013的“自杀”特性，最终在农杆菌中剩下微型Ti质粒和Ti质粒双元载体，此农杆菌可直接用于植物细胞转化。双元载体不需经过两个载体的共整合过程。因此构建的操作过程比较简单；由于微型Ti质粒较小，并无共整合过程，因此质粒转移到农杆菌比较容易，且构建的频率较高。另外，双元载体在外源基因的植物转化中效率高于一元载体。农杆菌有两大类,根癌农杆菌和发根农杆菌,前者含的是Ti质粒,后者含的是Ri质粒.如果你所用的根癌农杆菌本身所带质粒有抗性,比如我用的GV3101就抗利福平和庆大,做转基因时把构建好的表达载体导入农杆菌中,那么这个菌就带有双元载体,这是目前转基因用的较多的方法,在培养这个含双元载体的农杆菌一般要加三种抗生素,即利福平、庆大和表达载体所带的抗性，比如卡那。如果少其中的一两种也可以，比如可以不加庆大或利福平，加了当然比较好一点，能保证你的菌受污染的机会减少
