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1、壬基酚对成年雌性SD大鼠生殖功能的影响【摘要】目的：观察壬基酚对成年雌性SD大鼠生殖功能的影响。方法：对成年雌性SD大鼠每天灌胃壬基酚50、100、200gkg-1，阳性对照组每天灌胃乙菧酚0.2gkg-1，阴性对照组管饲花生油。通过阴道涂片观察性周期的变化，28d后处死大鼠，放免法测定血清雌激素、黄体生成素浓度，并作垂体、子宫、卵巢组织病理学检查，免疫组化技术检测子宫的雌激素受体ER表达情况。结果：壬基酚剂量100gkg-1可使大鼠出现持续动情期，血清雌激素、黄体生成素程度降低P0.05，卵巢组织病理学切片显示卵泡数目减少P0.05，子宫ER表达无明显差异。结论：壬基酚在较高浓度时可抑制雌性
2、大鼠的生殖功能。1材料与方法1.1实验动物雌性SD大鼠10周龄，质量210260g，共40只，购自东南大学医学院实验动物中心。1.2试剂壬基酚购于无锡市凌飞助剂厂，纯度99%。市售鲁花牌花生油由莱阳鲁花浓香花生油消费。乙菧酚由上海信谊康捷药业消费。雌二醇E2、黄体生成素LH放免试剂盒由原子高科股份消费。雌激素受体ER单克隆抗体为SantaruzBitehnlgyIn产品。DAB(二氨基联苯胺)、SP免疫组化试剂盒购自北京中杉生物技术。1.3动物饲养及分组大鼠以不含植物雌激素的饲料去除大豆喂养，每天上午9：0011：00阴道涂片，观察大鼠的性周期，观察4个周期，选用有正常性周期的动物进入实验。大
3、鼠随机分成5组，每组7只。实验组按壬基酚50、100、200gkg-1分为低、中、高剂量组，阴性对照组为管饲花生油，阳性对照组为乙菧酚0.2gkg-1。饲养28d，每天阴道涂片，观察动情周期，在动情期阴道涂片示大量无核角化细胞处死大鼠。10%水合氯醛每100g质量0.3l腹腔注射麻醉，眶后静脉丛采血，取血清置-70冰箱待用。按液体灌注固定方法，别离出垂体、子宫、卵巢，继续固定、脱水、透明，浸蜡包埋，制成4厚的石蜡切片。1.4E2、LH测定方法按试剂盒操作说明，采用放射免疫法测定上述待用血清中的E2、LH程度。1.5组织形态学观察及卵泡计数上述的切片HE染色，光镜观察。取最大剖面的切片，光镜下计
4、数具有正常卵泡构造的卵泡数双侧卵巢的卵泡数相加，分别测定各组大鼠的初级卵泡、生长卵泡、成熟卵泡、总卵泡数。卵泡分级标准为：初级卵泡直径2530，生长卵泡直径31400，成熟卵泡直径6507003。1.6ER的检测按SP法链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法进展免疫组化染色，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，3%过氧化氢室温孵育，微波修复抗原，羊血清封闭，37孵育15in，滴加1250稀释的ER兔抗大鼠单克隆抗体，4孵育过夜，再依次参加生物素偶联的羊抗兔IgG抗体和辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，各37孵育15in，DAB染色，显微镜下控制显色，苏木素复染，常规脱水、透明、树胶封片。阴性对照以0.05l
5、L-1PBS代替一抗，得阴性结果。以人乳腺癌组织作为阳性对照，得阳性结果。根据染色面积和强度按以下方法进展半定量评分：0,无染色或微弱染色；1,染色面积25%；2,染色面积在25%50%；3,50%染色面积75%；4,染色面积75%。1.7统计学处理实验数据用x-s表示，采用SPSS11.5统计软件，组间差异比拟用独立样本的t检验，免疫组化评分结果用成组设计两样本比拟的秩和检验ilxn，编秩后对秩次进展t检验，检验水准=0.05。2结果2.1壬基酚对性周期的影响成年雌性SD大鼠的正常性周期是45d，壬基酚100gkg-1组的大鼠用药7d后阴道涂片显示，出现大量有核上皮细胞动情前期和大量无核角化
6、细胞动情期的时间明显延长，而出现白细胞、少量角化细胞及有核细胞动情后期和大量白细胞、上皮细胞及黏液动情期间的时间缩短。200gkg-1壬基酚组和乙菧酚组的大鼠用药7d后，阴道涂片长时间观察到大量无核角化细胞，即出现持续动情期。阴性对照组和50gkg-1壬基酚组的大鼠直到处死前皆能观察到规律的性周期。2.2血清中的E2、LH程度100、200gkg-1壬基酚组和乙菧酚组的大鼠血清E2、LH程度均降低，与相应阴性对照组相比拟，差异有显著性P0.05表1。表1各组大鼠E2、LH测定结果1与阴性对照组比拟，P0.05；2与低剂量组比拟，P0.05；3与中剂量组比拟，P0.05；4与高剂量组比拟，P0.
7、052.3垂体、卵巢、子宫组织形态学变化2.3.1垂体各组均见嫌色细胞数量最多，成群分布，嗜酸细胞次之，嗜碱细胞单个分布，数量最少，血窦丰富，高剂量壬基酚组见到少量的凋亡小体图1、2。2.3.2卵巢阴性对照组可见原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡，黄体数目较多，间质少，间质腺少见，血管丰富。壬基酚各组随着剂量的增加，总卵泡数减少，尤其是成熟卵泡数减少最为明显，闭锁卵泡数增多，差异有显著性P0.05。乙菧酚组总卵泡数也明显减少，高剂量壬基酚组变化与此相似图3、4，表2。表2各组大鼠双侧卵巢卵泡数比拟与阴性对照组比拟，1)P0.05,2)P0.05；3与低剂量组比拟，P0.05；与中剂量组比拟
8、，4)P0.05,5)P0.05；6与高剂量组比拟，P0.052.3.3子宫各组大鼠子宫变化相似，黏膜厚，约占子宫壁的2/3，上皮以分泌细胞为主，固有层有大量子宫腺体，腺腔大，结缔组织疏松，有丰富的毛细血管及小动静脉。基层较厚，平滑肌细胞正常。2.4子宫ER的表达大鼠子宫组织ER蛋白主要表达在子宫内膜上皮细胞、子宫腺上皮细胞和平滑肌细胞的细胞核。ER蛋白表达半定量分析显示，壬基酚低、中、高剂量组分别为2.00.29、1.930.35、1.930.53,乙菧酚组为1.90.35,与阴性对照组2.070.35相比，差异均无显著性P0.05。3讨论本实验发现NP中等剂量组大鼠卵巢中的卵泡总数减少，尤其是成熟卵泡减少，闭锁卵泡增多。卵泡闭锁的发活力制尚未说明，可能与卵泡微环境内FSH和LH缺乏、卵母细胞和颗粒细胞凋亡等有关。
