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1、遗传标记STR基因座分型摘要 STR(short tandem repeat，短片段重复序列)广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，具有高度多态性，由核心序 列重复数目的变化产生长度多态性。由于人类基因组中这种重复序列非常多，通过对这种多态性的检测，就可以明确区分个 体与个体的不同，确定父母子的亲缘关系。我们通过磁珠法分别提前人类发根细胞中的基因组DNA，对于其中四个基因座 设计符合不同STR基因座分型扩增的引物，利用PCR扩增的方法获得大量扩增产物，再通过高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶 电泳的方法检测PCR扩增产物，通过不同的产物大小来判断STR在不同个体中的不同重复数目。1.引言20世纪90年代以
2、来PCR-STR分型已成为第二代法医DNA分型技术的核心。在人类基因组DNA中存在一类 串联重复序列，其串联重复单位核心序列数目在人群中存在较大差异，具有高度多态性，称为可变串联重 复序列(VNTR)。其中重复单位长度为2bp6bp的重复序列称为微卫星序列，也叫短串联重复序列(short tandem repea t, STR)。基因组中STR约有一半具有遗传多态性，因此可以通过对这种多态性的检测，就可 以明确区分个体与个体的不同，确定父母子的亲缘关系。DNA分型的理想STR基因座应具备以下特点：等位基因片段长度在95bp500bp范围，最好在400bp以 下；具有较高的杂合度及个人识别能力，
3、一般杂合度在0.70以上，DP0.90；具有规律的四核苷酸或 五核苷酸重复序列，阴影带出现率较低，较少或没有插入等位基因；等位基因数为1012个，等位基因 易于区分；突变率低，不超过0.2%；具有高度种属特异性。根据上述特点，FBI建立了13个STR基因座作为PCR-STR常用检测基因座1：表 1CODIS ST Rs Is ,&基因座染色体定位核心序列等位基因数片段长度K562D3S1358命AGA12103b(r 147bp16, 16VWA12pl2-pterTCTA/TCTG1013411r !70bp16, 16FGA4 28TCTT /CTTT22168bp 294bp24,21D
4、8S1179冏TCTff *12162bp- 206bp12.12D21SU21qli-ti2lTCTA/TCTG22172bp- 264bp31, 30, 29D18S5118q2L 3AGA A21271h旷 343bp6 15D5S8185q23.3-q32AGAT11135bp- 171bp12 JID13S31713q22p31A GAT9165b旷 197bp8.8D7S82G7qll.21-q22GATA9215bp- 247bp1L9D16S53916i|24jterAGAT1264b旷 304bp211THO I11 plS 5AATG8179bp 2O3bp9. * 9.
5、3TPOX2p23-plerAATG7224br- 252bp9,8CSFIPO5q33. 3-AGAT10293h旷 327bp10.9注：* N为T或G;* * R为G或A;* * * K562人口腔上皮粘膜细胞磁珠法提取基因组DNA原理：磁珠法中的细胞裂解液是一种蛋白变性剂，可使动植物的细胞裂解并 使与DNA结合的蛋白质变性、DNA游离释放，磁珠可以特异性地吸附DNA,通过洗涤去除DNA以外的 RNA、蛋白质等杂质，再用洗脱液解离吸附在磁珠上的DNA，得到纯度和浓度均很高的DNA，可用于PCR 扩增、酶切、分子杂交等。PCR扩增原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异
6、性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的 双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55C左右，引物与模 板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板一引物结合物在72C、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互 补的半保留复制链，重复循环变性
7、一退火一延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且 这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基 因扩增放大几百万倍。聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：PAG是由丙烯酰胺(acrylamide, Acr)单体和N, N-亚甲双丙烯酰胺(N, N, N， N-methylene bisacrylamide， Bis)交联剂通过自由基(free radicals)在过硫酸胺(NH4)2S2O8(Ammonium persulfate，AP)作为催化剂，四甲基乙二胺(-N,N,N,N-tetramethylethylene diamine , TEMED) 为加速剂的
8、作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在 很多溶剂中不溶；对pH和温度变化较稳定；几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条 件一致，则样品分离重复性好；样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g；凝胶孔径可调 节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；分辨 率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼 脂糖电泳等有更高的分辨率。本实验通过选取的是以下四
9、个基因座，设计合适的引物来扩增STR，通过高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶 电泳的方法来检测扩增产物。染色体定位樓心厅列PCR产恂大小(bp)左中槽評体的杂含性 (现察值HUMTH0111P15-I5.5(AATG)n155-1790. 7377HUMVWA12pl2 pter(TCTA)n135-1670. 8017HUMFES15q25 qter(ATTT)n213-2370. 6942HUMF13A6p2425(AAAG)n181-2350. 72042.材料和方法2.1实验材料材料：男生和女生的含毛囊的头发或口腔脱落的细胞；试剂和仪器：磁珠法提取DNA试剂盒，70%乙醇溶液，TE缓冲液，PCR
10、扩增仪，加样器，枪尖；PCR检测材料：上下游引物、10X PCR缓冲液，25mM MgCl? 2.5mmol/L dNTP原液，1 U/“ l Taq酶溶 液，ddH20。电泳试剂：凝胶贮液(30%ACr-0.8%Bis), 10%过硫酸铵，10%TEMED，1%琼脂糖溶液,EB染液，10X TBE，6X上样缓冲液(0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油于水中，4C贮存)，器材：垂直板电泳槽，稳压稳流电泳仪，紫外成像仪，2.2实验方法2.2.1第一周(5月23日)：【提取基因组DNA过程与SRY基因检测相同】获取实验材料：分别拔取三根男生和女生的带有毛囊的头发，用清水轻轻冲洗。科目遗
11、传学实验题目 遗传标记STR基因座分型提取发根细胞中的基因组DNA：（为了使实验进行的较快，我们组采用了磁珠法提取DNA的方法） 磁珠法：1、向1.5ml离心管加入380M Buffer MGL和20M Proteinase K从毛发根部取1cm长的含毛囊的毛 发加入上述离心管中2、 将上述离心管振荡混匀，65 C水浴20min,间或混匀，使样品充分裂解。3、向充分裂解的样品加入400M Buffer MA和10M Magicmag beads，振荡混匀10s.4、将离心管置于磁力架上，待Magicmag beads完全吸至管壁上之后，吸弃上清，从磁力架取出离心 管。5、加入700M70 %乙
12、醇，振荡混匀10s.将离心管置于磁力架上1min，待Magicmag beads完全吸至管 壁上之后，吸弃上清，从磁力架取出离心管。6、重复步骤5,室温开盖干燥15min至管内无残液。7、加入 15-25M TE Buffer, 65 C水浴 20min，间或混匀，离心 2min，8、将离心管置于磁力架上1min，待Magicmag beads完全吸至管壁上之后，吸取上清至新的离心管， 即获得基因组DNA。 碱裂解法：1、在一个200ulPCR管中加20p l的0.2mol/LNa0H溶液。剪下带毛囊的发根部分，放入管中并盖上 管盖，放入有热盖的PCR仪中，75C温育30min，以避免水分蒸发
13、。2、加入 50p l 的 0.04 mol/L HCl 中和。3、12000 r/min离心5min去除未溶解的沉淀物，上清转入1个新管，DNA就在水溶液中。2.2.2 第二周（5 月 30 日）设计引物：根据人的STR基因上四个基因座的序列，设计对应的四种不同的引物A、B、C、D （如下图）。HUMTH01 1.5-GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT2.5, -GTGATTCCCATTGGCCTGTTCCTCHUMVWA 3*5 -GGGATTTCCCTATGGATTGG4.5 -GCGAAAGAATGAGGACTACATHUMFES 5.5-CCCTAGTGG ATGG A
14、TGATA AGAATAATC&5-GGACAGATGATAAATACATAGGATGGATGGHUMF13A 7. 5* - ATGCCATGCAGATT AG A AA8. 5* -GAGGTTGCACTCCAGCCTTTPCR反应：1、按照设计的反应体系，分别在四个0.2 mlPCR管中（25p l/管）中加入下列试剂:试剂名称加入试剂的量/p l （终浓度）10XPCR缓冲液2.525mM MgCl22 (2mM)2.5mmol/L dNTP1 (0.1mmol/L)10 umol/L上游引物1 (0.4umol/L)10 umol/L下游引物1 (0.4umol/L)1 U/p l Taq酶溶液0.5 (2U/100p l)ddH2O15男生/女生的DNA2体系总量25在四个PCR管中加入的引物分别为A、B、C、D。2、混匀之后，瞬时离心。3、PCR扩增：变性94 r11min变性94 C60s复性60 r60s卜循环28次延伸72 C2min延伸60 C30min保温10Coo4、扩增产物冷却至室温可干40保存。2.2.3 第三周（6月6日）聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：1、安装夹心式垂直板电泳槽：（1）装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。（2）将长、短玻璃板分别插到“凵”形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。（3）将已插好玻璃板的
