《载体构建的基本步骤》由会员分享，可在线阅读，更多相关《载体构建的基本步骤（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、一. 载体构建原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。操作步骤摇菌取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100卩I菌种，过夜摇。提质粒依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。酶切按下表加入试剂。反应所需试剂体积（单位：ul）质粒10所需内切酶反应缓冲液2所需限制性内切核酸酶1出07将加好的EP管置于37C保温1-2h。（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应
2、温度）电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。1 连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接，连接体系如下：2 双蒸水5卩L10XT4DNA连接缓冲液1卩L载体2卩L酶切后的目的基因1卩LT4DNA连接酶1卩L总体积10卩L置于温箱，12-16C,保温8-16h转化依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37C,12-16h。3 单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3卩L的AMP，用枪头混匀；取1.5mlEP
3、管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500卩L上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。（2）单克隆检测以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR然后将PCR产物跑电泳，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再抽取100卩L,加到3ml（有LB液体培养液，AMP+）试管中，过夜摇；第二天重摇，将摇好的菌取1ml于1.5mlEP管中送测序，并保种。注：挑单克隆时，一定要挑单一圆润的菌落，有卫星斑的不挑。 别忘记往培养基中加AMP。 用接种环挑菌后，要在酒精灯上反复灼烧，然后再进行下一次挑菌。三注意事项1.连
4、接产物可短时间在-20C保存，使用时可以取出进行后续实验；2在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间；3连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要参数之一就是温度，因此要控制好连接温度。4进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题，常采用牛小肠碱性磷酸酶（CIF）去掉载体的5-磷酸以抑制DNA片段的自身环化。参考：1. 刘进元，常智杰，赵广荣,等.分子生物学实验指导M.北京:清华大学出版社，20022. 周俊宜.分子生物学基本技能和策略M.北京：科学出版社，2003：117-1203. 李海英，杨峰山，邵淑丽,等.现代分子生物学与基因工程M.北京:化学工业出版社，2008:138-1424. 朱旭芬.基因工程实验指导M.北京：高等教育出版社，2006:134-139
