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1、项目名称：首席科学家：与重要疾病相关膜蛋白的结构和功能施一公 清华大学起止年限： 2009.1 至 2013.8依托部门： 教育部一、研究内容本项目将主要进行以下几方面的研究：课题一解析在老年痴呆症中起关键作用的膜蛋白酶复合物Y -Secretase 的高分辨率晶体结构，在此基础上设计它的抑制剂；（占总经费的 32.5%）神经生物学研究证明导致奥兹海默综合症（Alzheimer s disease，即老年 痴呆症）的重要病原之一是卩-Amyloid（ A P ）多肽的积累。A0来源于Amyloid Precursor Protein （APP） o APP经过几次剪切最终产生出A P，其中有两
2、步剪切 （P和Y）是在细胞膜内进行的，而执行这种膜内剪切的蛋白酶是被称为Y -Secretase的膜整合蛋白酶。与其他膜整合蛋白酶不同的是，Y-Secretase不 是一个单亚基蛋白，而是由四个亚基组成，包括Presenilin （活性位点所在亚 基），Aph-1, Pen-2以及Nicastrin,四个亚基总共包含大约18个跨膜螺旋，其 中Presenilin含九个，Aph-1六个，Pen-2两个，Nicastrin 个跨膜螺旋。 Presenilin在y -Secretase组装的过程中经过剪切后形成两个紧密结合的结构 域：NTD和CTD。其活性中心起蛋白酶水解催化作用的关键氨基酸是两个天
3、冬氨 酸（Aspartate），但其具体催化机制至今没有准确解释。Y-Secretase不仅与老年痴呆症直接相关，而且越来越多的证据表明它可 以切割诸多跨膜底物，从而被称为生物膜中的蛋白酶体。因此解析Y-Secretase 复合物的结构具有极其重要的科学价值，其受关注程度与GPCR不相上下。根据现有科研文献报道，Y- Secretase复合物已经在昆虫细胞及CHO哺乳 动物细胞两个表达体系内成功表达及纯化，并具有生物活性，但产率偏低，还不 能完全满足大规模尝试结晶的需要。美国及日本的两个实验室分别用电子显微镜 观察其构象，得到了 15A和55A两个低分辨率的结构。后者由于分辨率太低， 难以提取
4、任何有实质意义的结构信息；前者的结构分析显示Y- Secretase复合 物似乎包含一个亲水性通道使它的活性位点与膜的两侧相通。但是由于分辨率 低，很难获得准确、肯定的结论。要揭示Y- Secretase复合物的结构、工作原 理以及根据结构设计其抑制剂，必须获得其高分辨率的原子水平的结构。我们计划同时用昆虫细胞及CHO哺乳动物细胞两个体系通过共表达各个亚 基来得到Y-Secretase复合物，纯化后检测其酶活性，并开始结晶的探索。整 个课题的瓶颈有两个，一是摸索合适的条件超量重组表达具有生物活性的Y-Secretase 复合物；二是摸索最优纯化条件及结晶条件。基于我们以前摸索的 膜蛋白的研究经
5、验，我们有信心在两至三年内解决这些瓶颈问题，进而进入到晶 体学实验及结构解析。本课题中的膜蛋白还没有同源结构。我们将结合计算生物学对这些膜蛋白 进行二级结构预测，帮助重组膜蛋白的工程设计，并以此作为模型系统开发膜蛋 白的三级结构预测新算法，进一步开发对膜蛋白功能及其它生物化学性质的预 测。将这些方法整合成一个膜蛋白结构预测和分析的系统平台。我们也将同时对 项目中其他课题组的目标膜蛋白进行预测分析，提供对于膜蛋白重组工程设计等 方面的有利帮助，加快实验科学家对目标膜蛋白结构的实验测定。一旦我们获得Y-Secretase复合物的结构，我们将采用成熟的分子模拟技 术开展膜蛋白与配基小分子的分子对接，
6、了解配基结合的机制，开展抑制剂的计 算机辅助筛选；开展膜蛋白与其它蛋白的相互作用研究；利用分子动力学模拟研 究膜蛋白与其它分子结合的动态过程。通过以上计算，期望获得一些膜蛋白功能 的新线索，可用于辅助实验科学家加快对目标膜蛋白的功能鉴定。课题二 解析与心血管疾病有直接关系的胆固醇代谢通路中的重要膜蛋白 SCAP, INSIG, SERBP及S2P的高分辨率晶体结构，阐释膜蛋白调控胆固醇代谢 通路的分子机理。(占总经费的 22.5%)本课题包含以下几方面内容：a. SCAP调控SREBP在细胞中定位的机理:SREBP( Sterol Response Element Binding Protei
7、n)是一类极为特殊的 转录因子23。它是通过两个跨膜螺旋被固定在内质网膜上的膜整合蛋白,起转 录作用的只是它的N端可溶结构域(转录因子)。当细胞内的胆固醇含量降低的 时候,这个蛋白首先要从内质网膜转移到高尔基体上,在那里它必须经过两步酶 切才能将其N端可溶结构域从膜上释放出来，进而被转运到细胞核中，激活与胆 固醇和脂肪酸合成、吸收相关的基因表达,从而提高体内胆固醇的含量23。当 细胞内的胆固醇水平足够高的时候,SREBP则被固定在内质网膜上。控制SREBP 在细胞中定位的是一个被称为SCAP (SREBP Cleavage Activating Protein)的 蛋白。SCAP的C端与SRE
8、BP的C端形成复合体，因而SCAP的细胞定位就决定了 SREBP的细胞定位。我们希望解析SCAP和SREBP复合体的结构，从而揭示SCAP 调控SREBP细胞内定位的分子机理。b. 胆固醇感应蛋白SCAP受胆固醇调控的机理:SREBP定位蛋白SCAP的N端近600个氨基酸形成了 8个跨膜螺旋，其中5 个螺旋组成被称为“胆固醇感应区”(Sterol Sensing Domain, SSD )的结构域 24。通过细胞和生物化学分析，已经知道这个结构域在结合胆固醇时会发生构 象变化，使SCAP不能再位于内质网，而转移到高尔基体上，从而携带SREBP也 定位到高尔基体25, 26。在那里，SREBP被
9、两个蛋白水解酶S1P和S2P切开， 从而释放出N端的转录因子进入到细胞核中，来激活一系列基因的表达。迄今为 止，我们对于SCAP这个胆固醇感应区(SSD )被胆固醇调节的机理一无所知，而 要阐明这一机理，最强有力的工具就是结构生物学。我们希望解析SCAP中胆固 醇感应区单独以及与胆固醇复合物的结构，从而揭示胆固醇调节SCAP构象的原 理并且设计胆固醇类似物。该研究对发展新型降血脂的药物具有重要意义。c. INSIG调控SCAP定位的分子机理:INSIG (Insulin-Induced Gene)包括 Insig-1 和 Insig-2，是位于内质网 膜上的整合膜蛋白，它们在胆固醇水平低的时候
10、，与SCAP形成复合物，从而把 SCAP以及与SCAP结合的SREBP “锁定”在内质网膜上；而当胆固醇水平升高， SCAP由于胆固醇感应区构象变化，便与INSIG分离，进而脱离内质网，携带着 SREBP进入到高尔基体上27。我们希望解析INSIG本身以及INSIG/SCAP复合 物的结构，从而揭示INSIG调节SCAP细胞定位的分子机理。d. 膜内金属蛋白酶S2P的工作机理:在上述的SREBP经历的两步水解中，第一步水解是由高尔基体腔囊中的一 个丝氨酸蛋白水解酶S1P执行的；第二步水解格外有趣，因为切割位点位于SREBP 的第二个跨膜螺旋中，即切割点是处于疏水的磷脂双层膜中。而行使切割作用的
11、 蛋白酶是一个有着6个跨膜螺旋的膜整合蛋白S2P。S2P在从细菌到哺乳动物的 进化中高度保守，唯一的结构是由施一公教授研究组在2007年底解析的一类古 细菌(M. jannaschii)中的同类物16。然而仍有许多问题没有解决，比如高 等生物与细菌的S2P结构是否相似；SREBP是如何被S2P识别的；S2P的活性是 如何被调控的，等等。我们希望解析真核生物S2P的结构，以及它与其抑制剂的 结构从而回答上述问题。e. 膜蛋白的结构预测新算法开发:本课题中的 S2P 已经有低级生物中的同源结构。我们将以此作为模型系统 开发膜蛋白的三级结构预测新算法，包括改进膜蛋白同源模拟中侧链的安装方 法，改进膜
12、蛋白 Fold Recognition 方法中弱同源性检测方法及弱同源序列比对 方法；进一步开发膜蛋白其它结构性质的预测。将这些方法整合成一个膜蛋白结 构预测和分析平台。同时对项目组中其他实验科学家的目标膜蛋白，进行预测分 析，提供关于膜蛋白结构方面的先验知识，以期帮助科学家进行有效的蛋白质工 程设计，加快实验科学家对目标膜蛋白结构的实验测定。f. 膜蛋白的分子模拟:一旦我们获得 SCAP 胆固醇感应区的结构，我们将采用成熟的分子模拟技术 开展膜蛋白与配基小分子的分子对接，了解配基结合的机制，开展抑制剂的计算 机辅助筛选；开展膜蛋白与其它蛋白的相互作用研究；利用分子动力学模拟研究 膜蛋白与其它
13、分子结合的动态过程。通过以上计算，期望获得一些膜蛋白功能的 新线索，可用于辅助实验科学家加快对目标膜蛋白的功能鉴定。课题三 探索 GPCR 的结构与功能及其结构生物学研究的新技术和新方法 (占总经费的 22.5%)本课题包含以下几方面内容：a. 使用盒式突变技术(cassette mutagenesis )获得可溶 GPCR的研究:GPCR 般由300400个氨基酸残基组成，处于细胞外的N-末端由30-50 个氨基酸组成，紧跟着的跨膜疏水区由7个a螺旋组成，位于胞内侧的C端 氨基酸残基差异较大，是与G蛋白相互作用的区域。我们拟采用渐进式的多 位点突变技术，以亲水残基系统性地替换GPCR蛋白跨膜
14、螺旋表面的多个疏水 残基，改善GPCR蛋白的水溶性。最终使跨膜结构域的疏水性质得到改变，从 而获得与自然状态下在膜系统中核心蛋白形态相似、功能相同的突变GPCR蛋 白。拟选择多巴胺受体(Dopamine receptors)作为模式系统，计划建立一个 有效的GPCR家族膜蛋白可溶性表达体系，并确定一个切实可行的蛋白质工程 策略。该方法将不仅仅适用于GPCR家族蛋白的研究，它对其它膜蛋白结构与 功能的研究也具有重要的、开创性意义。b. 使用融合蛋白技术(fusion protein )稳定GPCR构象提高其结晶成功 率的研究：GPCR中的7个跨膜a螺旋由6个loop区相连，其中连接2-3、-5和
15、6-7 a螺旋的loop区在胞外，分别称为E2、E3和E4,连接1-2、3-4和5-6 a螺 旋的loop区在胞内，分别称为Cl、C2和C3。比较大的C3 loop区具有很大 的柔性和亲水性，与 C 端共同负责与 G 蛋白的相互作用。众所周知蛋白质分 子的loop区，特别是柔性较大的loop区对蛋白质结晶是非常不利的。美国 斯坦福大学和Scripps研究所的研究组通过引入融合T4溶菌酶(T4 lysozyme) 的方法稳定了 C3loop区并获得了 2.4A分辨率的卩-肾上腺素受体(D2-Adrenergic Receptor )的晶体结构。该研究结果发表在2007年11月的2Science杂
16、志上并成为2007年度世界十大科学进展之一。显而易见，该方法 的成功无论是对GPCR、还是对整个膜蛋白研究领域都产生了巨大的影响。我们拟探索融合蛋白方法在其它GPCR结构生物学研究中的应用。以多巴胺 受体(Dopamine receptors)作为模式系统，研究融合蛋白方法稳定GPCR膜外 loop区的构象，增大蛋白质分子间特异性相互作用区域，从而改善结晶成功率。 我们拟联合使用盒式突变技术和融合蛋白技术，希望获得1-2个多巴胺受体或其 它膜蛋白的晶体结构，并对其结构与功能的关系以及与之相关的潜在药物或先导 化合物进行深入的研究。课题四 肺炎链球菌表面膜蛋白的结构与功能研究(占总经费的 22.5%)肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是链球菌属革兰氏阳性菌，呈 矛头状，成双排列，在痰和脓液中常形成短链状，无鞭毛，在人和动物体内 可产生荚膜。该菌经常存在于正常人
