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1、细胞或组织总蛋白提取与浓度测定（BCA法）实验步骤细胞或组织总蛋白提取与浓度测定1 细胞总蛋白提取（冰上防止蛋白裂解）1）吸去培养皿中的培养基，加入1 ml预冷PBS缓冲液洗3次。2）加入适量含lx蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液（10 cm培养皿中一般加入500卩1, 六孔板一般100微）。3）冰上裂解15-30 min，将裂解后的细胞用细胞刮子刮下，吸入1.5ml离心管中。（这个裂解时间的长短有没有影响不清楚，本人之前刮细胞太慢，常常最后 一个刮完后第一个已经裂解了好久，可能都要一个小时了，应该问题不大）4）在4条件下，12,000 rpm离心15 min，收集上清，即为细胞总蛋白。2 小鼠组
2、织总蛋白提取1）取小鼠组织约50-200 mg,加入500卩1预冷的含1x蛋白酶抑制剂的RIPA裂 解液。2）将小鼠组织剪碎，并用组织匀浆器匀浆。3）冰上静置30 min。4）在4条件下，12,000 rpm离心30 min。收集上清，即为组织总蛋白。3 蛋白浓度测定（ BCA 法）利用北京普利莱的BCA蛋白定量试剂盒（P1511）进行蛋白浓度测定，具体操作步骤如下：1 ）将BCA蛋白定量试剂盒中的BCA Reagent和Cu Reagent按照50:1的比例配 制成BCA工作液。2）将4 mg/ml的BSA溶液倍比稀释，配置成浓度为4、2、1、0.5、0.25及0.125 mg/ml的BSA
3、溶液作为蛋白标准品。3）在96孔板中每孔加入100卩1 BCA工作液，再加入5卩1蛋白样品或标准品， 每个蛋白样品需设两个平行孔，充分混匀，注意尽量避免出现气泡，37孵 育30 min。（这个时间说明书写的可室温俩小时，我在37度也放过很久，吃 完饭回来就去测）以 BCA 溶液作为空白对照，使用酶标仪测定 595nm 处的吸光度值。通过酶标仪自带软件拟 合曲线并计算每个样品的蛋白浓度。RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer）是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。（
4、感觉这 个总结不错）弱的裂解液适合做co-p,如果是胞浆蛋白，对裂解液强度要求不高，如果是 膜蛋白，要强裂解液。加了 SDS裂解能力就比较强。产品窖称WsstemJJ.lPaRIP煨摩莊FUF頌澎夜戸）RlPAWiSma黑簇1汾l?c Triton X-1QI Trrtnn X-1M.1% deaxycholsate,0.1% SDSIK NP-10, D.5% UQnxyrhnlale1% NP-4D, 0.25% 血 口 xy 匚 hnlats1% NP-+D1K.SDS御口涅印-B&aa咬抱駅至三的豌丽丽担鸟往粛化宦勻捶取弟抱接耘回于捱IP甘巻导亡娜引制是是是是是是昱呈至吕主妾庄沽V/B
5、 P.CQ- PIFWH, PWE, IP, CD-IFWE. IP.co-lWB: CHIP一些成分RIPA 裂解液(强)的主要成分为 50mM Tris(pH 7.4), 150mM NaCl ，l%TritonX-100 , 1% sodium deoxycholate 脱氧胆酸钠，0.1% SDS，以及 2mM sodium pyrophosphate ， 25mM p-glycerophosphate 1mM EDTA ， 1mM Na3VO4 ， 0.5 ug/ml leupept等多种抑 制剂。可以有效抑制蛋白降解。RIPA 裂解液(中)的主要成分为 50mM Tris(pH 7
6、.4), 150mM NaCl ，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate。裂解液中脱氧胆酸钠和原矶酸钠的作用前者是离子型去垢剂，后者是抑制酪氨酸磷酸酶活性的。离子型去垢剂主要作用有：1、裂解细胞；2、溶解蛋白，尤其是可以溶解一些难溶 于水的蛋白，如膜蛋白等:3、很适合做WB，但在Co-IP中使用，需要谨慎。Sodium pyrophosphate tetrabasic中文名为焦磷酸钠四元也称无水焦磷酸钠、磷酸四钠或TSSP , 是由焦磷酸盐和钠离子组成的盐，在实验室中用作缓冲剂。已证明其可用于制备用于土壤样品微囊素分析 的EDTA-焦磷酸钠萃取缓冲剂。磷酸钠也是一种
7、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶不可逆抑制剂。B-Glycerophosphate (sodium salt hydrate),别名 Glycerol 2-phosphate，简称 p-GP, 中文名为五水beta-甘油磷酸钠，或beta-磷酸甘油酯二钠盐五水合物，是小牛肌醇-1-磷酸 酶的底物，也是一种经典的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶可逆抑制剂和磷酸酶-张力蛋白同源物 (phosphate and tension homology deleted on chromsome ten, PTEN 的抑制剂，用于激酶 反应缓冲剂。B-Glycerophosphate常与其它磷酸酶以及蛋白酶抑制剂结合使用，用于广谱
8、抑制。NP-40是一种很温和的非离子型去垢剂，1%浓度基本可以破坏掉细胞膜，而对核膜的 破坏作用较弱，结合特定的缓冲液可以获得胞浆蛋白。与蛋白结合力强，用于防止物质分子 疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。尤其用于膜蛋白的非变性条件下的溶解。PMSF:可抑制丝氨酸蛋白酶例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，也可抑制半胱氨酸蛋白酶 和乙酰胆碱酯酶。EDTA:乙二胺四乙酸(EDTA)是一种有机化合物，其化学式为C,.H|6N O，常温常 压下为白色粉末。它是一种能与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe?+等二价金属离子结合的螯合剂 由于多数核酸酶类和有些蛋白酶类的作用需要Mg2+,故常用做核酸酶、蛋白酶的抑制剂 也可用于去除重金属离子对酶的抑制作用。选择裂解液要根据自己目标蛋白的位置，以及实验的用途，看好裂解液的成分，蛋白酶抑制 剂，磷酸酶抑制剂有没有添加BCA ( Bicinchoninic acid )法是目前应用比较广泛的蛋白质浓度测定 方法。基于双缩脲反应，即在碱性环境下蛋白质将Cu2+还原成Cu+， 产生一种紫蓝色复合物，在562 nm处有高的吸光值，该反应产物的量 与蛋白质浓度成正比。
