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1、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)是一类由配体激活的核转录因子，属II型核受体超家族成员,存在3 种亚型，即PPARa、PPAR PPARy，这三种亚型在结构上有一定的相似性，均含DNA结合区和配体结 合区等。PPAR 与配体结合后被激活，与 9-顺视黄酸类受体形成异二聚体，然后与靶基因的启动子上游的过氧化物 酶体增殖物反应元件(peroxisome proliferator response element, PPRE)结合而发挥转录调控作用。PPRE 由含相隔一个或两个核苷酸的重复序列AGGTCA组成。与配体结合后，PPAR在DNA结合区发生变构，进 而影响PPAR刺激靶基因转录的能力
2、。PPAR6几乎在所有组织中表达，浓度低于PPARa及PPARy，直至最近以前尚未找到此一核受体的选择性配 基。PPAR6是代谢综合征(肥胖、胰岛素抵抗、高血压是与脂质紊乱有关的共同的病态表现)的一个新靶 点。有不少的研究表明：GW501516可作为PPAR6的特异激动剂用于研究参考网址：http:/ Regulati on of Muscle Fiber Type and Running En dura nee by PPAR6plos biology， Volume 2 | Issue 10 | October 2004 http:/www.plosbiology.org/plosonli
3、ne/?request=get-document&doi=10.1371%2Fjournal.pbio.0020294NF-KB通路中的抑制剂好像有l.PDTC(pyrrolidine dithiocarbamate),是一种抗氧化剂，主要作用于IkB降解 的上游环节(iKBa的磷酸化或IKK的活性水平)，2.Gliotoxin是一种免疫抑制剂，机制可能从多个环节阻 断NF-KB的激活，如IkB的降解，NF-KB的核移位和与DNA的结合。3.PSI (proteasome inhibitor)。以上 好像美国Sigma公司有生产。http:/ 性的两种。Daines等，使用detergent-
4、sensitive factor，非特异的阻断STAT6/STAT6二聚体入核。详见下 列文献：1， Daines MO, Andrews RP, Chen W, El-Zayaty SA, Hershey GK.DNA binding activity of cytoplasmic phosphorylated STAT6 is masked by an interaction with a detergent-sensitive factor . J Biol Chem. 2003 Aug 15;278(33):30971-4. Epub 2003 May 302， Andrews RP,
5、 Ericksen MB, Cunningham CM, Daines MO, Hershey GK. Analysis of the life cycle of stat6. Continuous cycling of STAT6 is required for IL-4 signaling. J Biol Chem. 2002 Sep 27;277(39):36563-9. Epub 2002 Jul 16Lisa 等人， 通过改变核定位分子 nuclear localization signals (NLSs) 和接头分子 adapters of the karyopheri n-arf
6、a/import in-arfa (Kap-arfa/imp-arfa) family 特异的阻断 in port in-beta 介导的入核。详见下 列文献：Lisa M. Nelson, Robert C. Rose, and Junona Moroianu. Nuclear Import Strategies of High Risk HPV16 L1 Major Capsid Protein. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. Vol. 277, No. 26, Issue of June 28, pp. 23958-23964, 2002曲古抑
7、菌素（TSA）,可以延长NF-KB在核内的时间，阻止NF-kB出核FK506,而非FK509，可以减少神经钙蛋白（calcineurin）对NF-AT的去磷酸化，使NF-AT的核定位信号无 法与转运蛋白结合，阻止其入核针对NPC上核孔蛋白的抗体，也可干预NPC作用，使经过NPC的入核作用受损PPAR家族简直可以竞争近几年的靶点之星了。关于响应元件 PPRE， ppar-gamma 和 PPAR-alpha 的是一样的， PPRE 是以 AGGTCANAGGTCA 这样一个AGGCTA二倍体作为基本单元的,delta的有所不同。PPAR跟激动剂结合以后，跟9-顺视黄酸类X受体（RXR） 组成异二
8、聚体，分别各自结合一个AGGTCA,从而刺激靶基因转录。已经上市的 PPAR 激动剂药物都是 gamma 的，都是具有噻唑烷酮结构的化合物，比如 pioglitazone, rosciglitazone，troglitazone（因肝毒性被叫停）PPAR家族主要参与脂肪代谢，并进一步参与糖代谢。目前研究显示，PPAR不仅仅是II型糖尿病的靶点， 其他相关的重要疾病有高血脂，炎症（动脉粥样硬化），癌症（胃癌和脂肪癌），肥胖。这些还需要进一步 研究，特别是 delta 的作用。方便的研究PPAR的转录激活作用，特别是高通量筛选（high highthroughput sceening） PPAR激
9、动剂，没 有比报告基因更好的方法，可以方便而灵敏的检测了。活化T细胞核因子（NFAT）活化T细胞核因子（Nuclear Factor of Activated TCells ,NFAT）在免疫反应中对诱导基因转录起重要作用。NFAT蛋白在T细胞及其它类型的免疫细胞中如B细胞、NK细胞、肥大细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞 上表达1 ,2 oNFAT蛋白因那些与Ca2 +动员连接受体的激活而被活化，如T和B细胞的抗原识别受体、 肥大细胞和嗜硷性粒细胞的FceR等。受体的激活和Ca2 +动员导致了许多细胞内酶包括依赖Ca2 +/钙 调蛋白的磷酸脂酶Calc in eurin的活化,Calci neur
10、in是活化T细胞核因子发挥作用的主要激活因子1 。 受激细胞诱导一大批与活化有关的基因转录，许多基因都可能是NFAT的靶基因，这些基因编码转录因子、信 号蛋白、细胞因子、细胞表面受体和其它效应蛋白。免疫抑制药物 FK2506 和环孢菌素 A 通过抑制Calc in eur in可阻断3种抗原受体通路（NFAT、NFkB和JNP）,抑制成熟淋巴细胞增殖3 。作为 Calci2neurin的底物,NFAT是FK2506和环抱菌素A主要的靶，1 结构已知有4种哺乳类NFAT基因,它们编码约含7001000个氨基酸残基的蛋白质。在NFAT蛋白中，有两个 相邻的非常保守的区域即NFAT同源区（NHR ,
11、约300个氨基酸残基）5 和DNA结合区（DBD，约270个 氨基酸残基） 6 。 NHR 和 DBD 夹在两条多肽链两端多变的转录活化区之间7 。 NFAT1 的分析表明 NFAT蛋白的氨基端和梭基端都含有转录活化区（TAD）。2 分类NFAT1、NFAT2、NFAT3 和 NFAT43 调节Calc in eurin在NFAT活化中起着十分重要的作用。NFAT的活化有三步:脱磷酸、核易位、对DNA亲和力 的提高。（1）在静止细胞中,NFAT蛋白被磷酸化，存在于胞浆，对DNA具低亲和力。（2）引起Ca2 +动员 的刺激物导致NFAT的快速脱磷酸和入核;脱磷酸的NFAT对DNA的亲和力增高。N
12、FAT蛋白的活化紧随Calcineurin的活化之后，在T细胞中，游离的Ca2 +水平高,Calcineurin的活性就高,NFAT1就能在核内保 持长时间的活化状态。如果去除Ca2 +刺激物ion omycin或加了 Calc in eurin的抑制物环抱菌素A和FK506 而使Calc in eur in的活性受到抑制，则NFAT1在515分钟内恢复磷酸化状态,并回到胞浆内，对DNA亲和 力大大降低10 。用Calc in eur in或硷性磷酸酶作用于细胞提取物可引起NFAT1DNA结合力的提高12 。 这说明磷酸化的残基直接或间接掩盖了 NFAT1 中的 DNA 结合区,而脱磷酸可能通
13、过 NFAT 内在构象的改 变，暴露这些区域使其易于被接近。除Calcineurin之外还有很多蛋白和信号通路可以调节NFAT。TCR参 与的通路:TCR交联引起的最早结果是酪氨酸激酶包括Lck和ZAP270的活化以及包括引起Vav在内的许 多细胞内底物的酪氨酸磷酸化丄ck和ZAP270的活化引起T细胞内的Ca2 +动员13 ，由此引起依赖 NFAT的报告基因表达。PMA激活的信号通路:已知PMA在T细胞内的作用是激活蛋白激酶C、Ras、 Raf ,(1)Ras 对于 NFAT 的功能是必不可少的 ,活化的 Ras 可以有效地代替 PMA ,同基础的活化的 Calcineurin 一起为依赖
14、NFAT 的报告基因表达提供充分刺激,而显性阴性的 Ras 则抑制 TCR 引起的 NFAT 活化。Ras有多种多样的效应蛋白如Raf、Ras、与Ras有关的GTP酶Rac和Rho。(2) Raf通路对于 AP-1的诱导是很重要的,Raf可以激活MEK1 (有双向活性的激酶)，而MEK1又可激活MAP激酶EPK1和 ERK2。在T细胞中，活化的Raf和ERK1代替PMA与ionomycin协同刺激NFAT驱动的转录，但不如活化 的Ras有效。同时，这些蛋白质的显性阴性形式也仅部分抑制Ras介导的活化。(3)另一种Ras的效应蛋 白的活性形式Rac21，可通过不含ERK的通路最大限度地激活,AP
15、-1驱动的报告基因的表达，即使是与 ionomycin或活化的MEK1联合以后也是如此。综上，说明T细胞中存在另一条Ras效应蛋白通路并为最 大限度地表达NFAT:AP21驱动的报告基因所需15。关于这条通路目前还不清楚。与Ca2 +动员有关 的通路：Ca2 + i的增加可激Calc in eurin，也可导致其它依赖Ca2 + /钙调蛋白激酶的激活。其中，两种有 多种功能的激酶(CaMK)可以调节NFAT的活性。在T细胞中CaMKIIyB能部分抑制人Jur / ket细胞中 NFAT 和 AP21 驱动的报告基因表达 ,且抑制活化 Calcineurin 加强 IL22 启动子功能16 。而活化的 CaMKIVPGY具有相反作用，通过激活AP21大幅度地加强NFAT活性。CaMKIVPGy通过上调血清反应因子 (SRF)的转录功能和随后的c2Fos诱导引起NFAT活性加强且不被显性阴性形式Ras抑制。这两种CaMKs 的相反作用与它们对不同细胞内底物的靶作用有关17 。4 功能细胞因子基因调节区中的NFAT结
