各种酶活性测定方法

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1、各种酶活性测定方法各种酶活性测定方法第一 超氧化物歧化酶SOD测定一、原理 超氧物歧化酶（superoxidedismutase, SOD）普 遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子 自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝 四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大 小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原， 被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产 生O2,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者 在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2， 从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反 应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈 高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（

2、一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1高速台式离心机；2分光光 度计；3微量进样器；4荧光灯（反应试管处照 度为4000Lx）； 5试管或指形管数支。（三）试剂005mol/L磷酸缓冲液（pH78）； 2130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet 用 磷酸 缓 冲液 定 容 至 100ml ；3750pmol/L氮蓝四唑溶液：称取006133gNBT用磷酸缓冲液定容至 100ml，避光保 存；4.100mol/L EDTA 一 Na2 溶液： 称取 003721gEDTA - Na2用磷酸缓冲液定容至 1000ml； 5. 20pmol/L 核黄素溶液：称取 0.07

3、53g 核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。三、实验步骤1. 酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要 定，去叶脉）05g于预冷的研钵中，1ml预冷的 磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体 积为5ml。取152ml于1000rpm下离心20min, 上清液即为SOD粗提液。2. 显色反应 取5ml指形管（要求透明度好）4 支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加 入各溶液：试剂（酶）用量血）终浓度（比色 时）0.05mol/L 磷酸缓冲液 15130mmol/L Met溶液 0.313mmol/L 750pmol/L NBT 溶液0.375pmol/L 100pmol/L EDTA

4、 Na2 液0.310pmol/L 20pmol/L 核黄素 0.320pmol/L 酶 液 0.052 支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水 0.25总体积 3.0混匀后将 1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min （要求各管受光 情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。3. SOD活性测定与计算至反应结束后，以不 照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光 度。四、结果计算 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的 50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD 总活AE）xV/（Ackx0.5xWxVt）上式中，SOD比活*=SOD总活性蛋白质含量 式中SOD总活性

5、以每克鲜重酶单位表示；比活 力单位以酶单位/ mg蛋白表示Ack照光对照管 的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml） Vt测定时样品用量（ml） W样鲜重（g） 蛋白质含量单位为：mg蛋白/g鲜重。SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法 缩写：SOD：超氧化物歧化酶；CAT：过氧化氢 酶；POD：过氧化物酶；MDA：丙二醛；PVP： 聚乙烯吡咯烷铜K-30； L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三 氯乙酸；PBS:磷酸缓冲液1. SOD的测定方法加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液：1.5ml L-Met:0.3ml NBT: 0.3mlE

6、DTANa2: 03ml核黄素：03ml酶液：005ml 蒸馏水：0. 25ml试剂配制：(1) 0. 05mol/L PBS： pH7.8(2) 130mmol/L LMet: 1 9399g Met 用 PBS 定 容至100ml(3) 750mmol/L NBT: 0. 06133g 用 PBS 定容至 100ml (避光保存)(4) 100umol/L EDTANa2: 0. 03721g 用 PBS 定 容至1000ml(5) 20umol/L 核黄素：00753g用蒸馏水定容至 1000ml （避光保存）注：(1)对照：以加缓冲液、不照光为空白； 照光的为最大还原管(2)照光后至显

7、蓝色要立即避光放置、迅速 测定A560值2. MDA的测定方法试剂配制：(1) 5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml(2) 0.5% TBA： 25g 用 TCA 定容至 500ml 方法：酶液1ml3ml05%TBA和5%TCA混合后在100 度水浴煮沸15min迅速冷却，10000r/min离心 10min用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、 600nm处的吸收值3. POD的测定方法试剂配制：(1)01mol/L的醋酸缓冲液：8. 8mlA+41 2mlB 得到|lph5.4的醋酸缓冲液A(0.2mmol/L的HAc溶液)一6ml冰醋酸溶 到494ml蒸馏水中B(02mmol

8、/L 的 NaAc 溶液）一13 6gNaAc 3H20(2) 0.25%愈创木酚溶液一125um愈创木酚溶于 50ml 50%乙醇中(临用前配制)(3) 075%H202 溶液：1. 25ml 30% H2O2 定容至 50ml (临用前配制)方法：比色杯中依次加入2ml O.lmol/L的醋酸 缓冲液一1ml 0. 25%愈创木酚溶液一xml酶液(5min 值为 500800 即可)一0. 1ml 0. 75%H2O2 溶液一迅速巅到混匀把A460调零并开始计时 一1次/30s,连续读取3min4. CAT的测定方法试剂配制：(1) 50mmol/L 的 PBS (pH7.0)(2) 0.

9、3%H2021ml H202 定容至 100ml方法：以不加H202的50mmol/L的PBS(pH7.0) 为空白把A240调零(2) 50ul 酶液一3ml 50mmol/L 的 PBS (pH7.0) 02ml 0.3% H202迅速颠倒混匀，开始计时 一1min后在240nm下比色，1 次/1min(连续读取 5min)。2010年06月22日星期二19:331 叶绿素含量测定：80%的丙酮液的配制：4L丙酮+ 1L蒸馏水。11重复），加入25ml浓度为80%的丙酮液，放在 黑暗处浸提大约36小时后取岀，稀释4倍后分 别在波长 663nm、645nm、652nm 和 470nm 下 测

10、定光密度，以80%的丙酮液为空白。（参考陈 建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指 导，P3536）也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm处 有最大吸收峰Ca=1395D665-68圖649Cb=2496D649-732D665Cxc=（1000D470-205Ca-114Cb）/2452抗氧化酶活性的定：（25g样）0.05mol/L磷酸缓冲溶液（PBS） （pH=78）溶液 的配制：655506g Na2HPO4 12H2O + 265285g NaH2PO42H2O,定容到4L。（参考陈建勋，王 晓峰主编的植物生理学实验指导，P134）。 取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根

11、） 放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨）,8000r/min的冷冻离心机下离心 20分钟，上清液为粗酶液。2.1丙二醛（MDA）的测定：20%三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三 氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。（参考陈建勋， 王晓峰主编的植物生理学实验指导124）； 0.5%硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称5g 硫代巴比妥酸（TBA）,用20%三氯乙酸（TCA） 溶液溶解并定容到1000ml。（参考陈建勋，王晓 峰主编的植物生理学实验指导124）（先加

12、少量的氢氧化钠1mol/L溶解）；0.5ml 酶液（对照用 0.5ml 的 0.05mol/L pH=78 的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+ 3mlTBA振荡沸水浴上反应30min 冷却（至少30min） 比色（0D600、OD532、 OD450）。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生 理学实验指导，P124）2.2超氧化物歧化酶（SOD）的测定：NBT（400ml）混合反应液：392mlPBS（Ph=7.8）,+0.0206g NBT+ 0.776g 甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+04ml EDTA-Na溶液（100mlPBS 缓冲溶液中含 0.01204g 核黄素）。（ 另 配 ） 10

13、0ml PBS 溶 液 加 EDTA-Na 37224gEDTA-Na测试时:取3ml反应液+005ml（根）或0.02 ml（叶） 粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下 测定吸光度。2.3过氧化物酶(POD)的测定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS) (pH=70)溶液的 配制：10.9251g Na2HPO412H2O + 3042975g NaH2PO42H2O,定容到 1000ml。03%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液（PBS）定容到 250ml o0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚， 用0

14、.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液（PBS）定容到 250ml o2ml 0.3%H2O2 溶液 + 0.95ml 0.2% 愈创木酚溶 液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS) + 0.02ml?(原来为 0.01)酶液(根加 0.05ml酶液）（对照用 0.05mol/L 磷酸缓冲溶液代替酶 液）（做三个重复），记录 470nm 处 OD 降低速 度。将每分钟 OD 增加 0.01 定义为 1 个活力单 位。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学 实验指导P121） 比色时加酶液，混合后即刻计时。2.4脯氨酸的测定标准曲线的制作：编号1267标准脯氨酸

15、的量（ml）00.10.20.40.60.81.0H2O（ml）1.00.90.80.60.40.2厂33333脯氨酸含量（pl）012468100.5ml酶液（对照用0.5ml 80%乙醇代替）（做三 个重复）+ 1ml冰乙酸+ 1.5ml显色液混匀，沸水浴15min，冷却后测OD520。Ill2.5可溶性蛋白的测定（参考赵志杰，史国安， 董新纯编的植物生理学实验指导） 牛血清白蛋白：配成100pgml和1000pgml。 90%乙醇：90ml乙醇+ 10ml蒸馏水。？85%（W/V）磷酸：170ml磷酸+ 30ml蒸馏水。 考马斯亮蓝G-250:称 0.2g考马斯亮蓝G-250溶 于100ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸 200ml,用蒸馏水定容到2L。常温下可保存一个 月。标准曲线的制作：配制0100gg/ml血清白蛋白血液管号1234100pg/ml牛血清白蛋白(ml)0.20.40.60