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1、影响PCR的主要因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物 设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR 自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种 主要影响因素介绍如下。一、温度循环参数在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是： 94C60s, 37C60s, 72C120s，共2530个循环，扩增片段500bp。在这里，每一步的时间应从反应混合液到
2、达所 要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要3060s，这一迟滞时间的 长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源水浴或加热块以及两步骤间的温度差， 在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前 文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作一介绍。1. 模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板， PCR也就不会启动。变性温度低则变性
3、不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取9095C。样品一旦 到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短， 以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95C。2引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合,DNA 扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37C反应条件开始， 设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。也可根据引物的G+C含量进行推测，把握试验的 起始点，一般试验中退火温度Ta
4、(annealing temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低5C, 可按公式进行计算：Ta = Tm -5C= 4(G+C)+ 2(A+T) -5 C其中A, T，G，C分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果G+C含量为50%时，则Ta的起 点可设在55C。在典型的引物浓度时如0.2umol/L，退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。3. 引物延伸温度温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的最适温度。一般取7075C，在72C时酶催化核苷酸的 标准速率可达35100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1 kb的长度，其速度取决于缓冲
5、溶液的组成、pH值、盐浓度与 DNA模板的性质。扩增片段如短于150bp,则可省略延伸这一步，而成为双温循环，因Taq DNA聚合酶在退火温度 下足以完成短序列的合成。对于100300bp之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效的。此时， 引物延伸温度与退火温度相同。对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延伸时间控制在17min，与此同时， 在PCR缓冲液中需加入明胶或BSA试剂，使Taq DNA聚合酶在长时间内保持良好的活性与稳定性；15%20%的甘油 有助于扩增2.5kb左右或较长DNA片段。4. 循环次数常规PCR 一般为2540个周期。一般的错误是循环次数过多，非特异
6、性背景严重，复杂度增加。 当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。扩增结束后，样品冷却并置4C保存。二、引物引物设计要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物，所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核 苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5端决定扩增产物的两个5末端位置。由此可见，引 物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更为重要。引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的，两引物之间的序列未必清楚，这两段已知序列 一般为1520个碱基，可以用DNA合成仪合成与其对应互补的二条引物，除此
7、之外，引物设计一般遵循的原则包 括：1. 引物长度根据统计学计算，长约17个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机率的为1次。因此， 引物长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最正确长度为2024个核苷酸。这样短的寡 核苷酸在聚合反应温度通过72C下不会形成稳定的杂合体。有时可在5端添加不与模板互补的序列，如限制 性酶切位点或启动因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测 等各种目的。有时引物不起作用，理由不明，可移动位置来解决。2. G+C含量引物的组成应均匀，尽量防止含有相同的碱基多聚体。两个引物中G+C含量应尽量相似， 在
8、已知扩增片段G+C含量时宜接近于待扩增片段，一般以40%60%为佳。3. 引物内部应防止内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构hairpin structures。例如：4. 引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3端，即使无法防止，其3端互补碱基也不应大于 2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体” Primer dimer。所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合 酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA片段，是PCR常见的副 产品，有时甚至成为主要产物。另外，两条引物之间防止有同源序列，尤为连续6个以上相同碱基的寡核苷酸片段，否则两条引
9、物会相互竞争 模板的同一位点；同样，引物与待扩增靶DNA或样品DNA的其它序列也不能存在6个以上碱基的同源序列。否则， 引物就会与其它位点结合，使特异扩增减少，非特异扩增增加。5. 引物3端配对DNA聚合酶是在引物3端添加单核苷酸，所以，引物3端56个碱基与靶DNA的配对要 求必须精确和严格，这样才能保证PCR有效扩增。引物设计是否合理可用PCRDESN软件和美国PRIMER软件进行电脑检索来核定。人工合成的寡核苷酸引于最好经过色谱层析纯化或PAGE纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。纯 化引物在25%乙腈溶液中4C保存可阻止微生物的生长；一般情况下，不用的引物应保存在-20C冰箱中，在液
10、体中 引物能保存6个月，冻干后可保存12年。三、DNA聚合酶早在1956年Kornberg等就从大肠杆菌提取液中发现了 DNA聚合酶，并且得到了 DNA聚合酶I纯品。DNA聚合 酶I是由分子量为109000的一条多肽链构成,此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段，一个片段分子量为76000, 有聚合酶活性，并有3-5外切酶活力，即Klenow片段Klenow fragment。另一个片段分子量为34000，具有 5 3外切酶活力。因此,DNA聚合酶具有几种功能：一是聚合作用，以DNA为模板，将dNTP中的脱氧单核苷 酸逐个加到3-OH末端。二是有3 5外切酶活力，能识别和消除错配的引物末端，与复
11、制过程中校正功能有 关。三是5 3外切酶活力，它能从5端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。1985 年Mullis等发明了 PCR方法，以Klenow片段完成B-珠蛋白的PCR后，世界上许多实验室就考虑用耐热DNA聚合 酶代替Klenow片段进行PCR，使耐热多聚酶的研究得以迅速发展。人们从生活于60CB.Stearothermophilus 到87CS.Solfatavicus的许多菌中别离纯化出耐热DNA聚合酶，但有些酶不能耐受DNA变性所需温度，所以无 法应用于PCR。现就PCR反应中常用的DNA聚合酶等作一详细介绍。1. Taq DNA聚合酶用Taq DNA聚合酶
12、代替大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段是使PCR普及应用的关键oKlenow 片段不能耐受95C的双链DNA变性温度，所以每次循环都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受9395C的高 温，防止了不断补加多聚酶的繁琐操作，同时使退火和延伸温度得以提高，减少了非特异性产物和DNA 二级结构对 PCR的干扰，增进了 PCR特异性、产量和敏感度，二者相比，其主要区别在于：Klenow酶的最适温度为37C，扩 增的产物并非全是目的序列，需用探针检测。Taq酶则不仅产率高而特异性也高。它的最适温度为7475C。因而 使退火温度可以提高，使退火严格性提高，减少错配引物的延伸。循环后期酶量渐感不足
13、而产生平坡。到达平玻 的循环次数，Klenow酶为20个均用lug基因组DNA开始而Taq酶为30个。延伸片段长度Taq酶为10kb 以内，而Klenow酶为400bp以内。Taq酶由水栖高温菌Thermus aqua ticsYT1 蓖株中别离而得。此菌于1969年由Brock别离自美国黄石公园 温泉，作为栖热杆菌的标准菌株，其生长温度为7075C。最初从中别离到分子量6068KDa，比活性为2000 8000U/mg的DNA聚合酶。后来Cetus公司的Kary Mullis等又别离到比活为20万U/mg的纯酶，分子量为93910。 此种9.4KDa酶的最适温度为7580C，与单纯核苷酸的结
14、合率Kcat可达150核苷酸nt/s酶分子。以 模板，用富含G+C的30bp引物延伸，70C时Kact60nt/s；55C可达24nt/s；37C时为1.5nt/s，而22C时低至 0.25nt/s。高于90C时DNA合成活性甚差，这种高温条件下，引物与模板已不能牢固结合。在PCR反应混合液中，Taq酶于92.5C,95C及97.5C保持其50%活力的时间分别为130、40及56min，在 50次循环的PCR中当管内最高温度为95C。每循环为20s时尚可保持65%活力Taq酶在95C的半寿期为40min, 故在PCR循环中选用的变性温度，不宜高于95CoTaq酶现已可用基因重组的方法生产，商品
15、名为Ampli TaqCetus公司。Taq酶的完整基因长2499bp，在大 肠杆菌中表达生产，含832个氨基酸。在氨基酸序列上与大肠杆菌DNA聚合酶I有38%是一致的,包括对dNTP结合， 引物与模板作用区均存在于Taq酶中。Taq酶具有依赖DNA合成的5 3外切酶活性，因此，模板上有一段退火的3-磷酸化的“阻断物”，会 被逐个切除而不会阻止来自上游引物链的延伸，而对于5 -32P标记的合成寡核苷酸引物，则无论是单链或是与模 板复性，都未发现降解，所以该种活性不会影响PCR结果Taq酶没有3 5外切酶活性，如果发生dNTP错 误掺入，这种酶没有校正能力，因此运用Taq酶进行PCR，产物中点突
16、变较多，对克隆等不太有利。一般错掺率为 1.25X10-41X10-5（4XdNTPs 浓度分别为 200 umol/L，Mg2+为 1.5mmol/L,在 55C退火）。但不含 3-5外切酶活 性对测序有利。2. 影响酶活力的因素Taq酶的活力受Mg2+离子的影响。用鲱精DNA为模板，总dNTP浓度0.70.8mmol/L,Mg2+ 为2.0mmol/L时激活能力最高。浓度超过此值产生抑制。10mmol/l MgCl?抑制活力达40%50%。dNTP能与Mg2+结合， 故游离Mg2+只是结合后剩余的量。假设总dNTP浓度高至46mmol/L时,Taq酶活力要降低2030%，即底物抑制。dNTP浓度低时PCR产率及特异性均增高，
