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1、1回顾样品信息样品的分子量、pka、酸碱性流动相需要缓冲盐吗？酸性、碱性化合物需要加缓冲盐来控制流动相pH样品需要预处理吗？有损坏色谱柱的、干扰检测的成分则预处理2明确分离目标足够的分离度、最短的分离时间、精确度等3展开起始的分 离色谱柱：100mm*4.6mm*3um, C18或者C8 （或者其他大小和 内径）流速：2ml/min柱温：30C 或 35C流动相：样品不含酸和 碱：乙腈和水流动相：样品含酸和碱： 乙腈和（pH2.5-3.0 ）（10-25mmol/l）缓冲盐根据样品pka选择流动相的pH （流动相的pH在样 品的pka1.5的外）,根据流动相pH选择缓冲液， 尽量选择pka与流
2、动相的pH相等的缓冲盐，浓度经 常为5-50mmol/l。磷酸盐、乙酸盐、甲酸盐都是在 pH小于8时最常用的缓冲液。梯度：10分钟内5%100%B3.1.遇到的问题：过早洗脱（说明 样品的极性大， 离子化的酸或 碱）可以减少起始的B或者使用起始梯度停留改变流动相的pH增强他们的保留（减少分子的离子化）在流动相中加入离子对试剂使用正相色谱或者HILIC过迟洗脱（样品 的极性很小）使用亲酯性较弱的色谱柱（降低H值，见附件1）使用正相色谱复杂的样品（样 品大于15种成 分）如果都是目标化合物，可使用2D色谱几个化合物是目标成分：样品先预处理4优化梯度色保 留因子k起始的分离条件对于大多是小分子样品（
3、分子量V1000） 般能使k值大约为55优化梯度选择 性梯度时间和柱 温是首选。建议第二个方法将梯度时间延长2-3倍，在没有分开的情况 下可以进一步延长时间获证增加柱温为50C5.1 :加入步骤5 的分离度2,或 者需要增短时间用甲醇替代乙腈重复步骤1-4更换色谱柱重复步骤1-4考虑使用分段梯度6调整梯度范围 和形状A:考虑最佳的起始和最终的B值，从而在分离度Rs合理的前提下实现最短的 实验时间B：对于“较脏的”的样品，加入坡度较大的梯度分段至100%B （例如在5min 至 100%B，维持 3-5min 等）C:加入坡度较大的梯度分段来加速色谱图后端的、间隔较宽的色谱图峰的洗脱D:加入的等
4、度度停留从而改善梯度前洗脱出来的色谱峰之间的分离度精品7以步骤5、6中 获得的最佳的分 离效果为基础， 平衡分离度和运 行时间改善色谱柱的 条件色谱柱的大小、粒径、 流速、样品的分子量运 能影响色谱柱的塔板 数。粒径和色谱柱的大 小通常在方法建立之 前已选好。增长色谱柱 的长度通常能增加塔 板数、分离度、实验时 间。在梯度洗脱中，使 tgF/L保持恒定，从而 使保留因子K*保持恒 定。保留因子K:tg:梯度时间；F：流速；Vm：死 体积；A 0：梯度范围；S：分 子量在100-500Da的样品S值为 4。8测量连续的阳 阳机那样之间， 色谱柱的必要平 衡时间以上面选好的 实验条件开展 连续几次
5、同样 的分离，并同时 改变进样之间 的平衡时间；选 择能给出合理 分离效果的的 最短的平衡时 间一般使用10个或者以上的色谱柱体积的其实流动相来平衡 色谱柱（约等于10乘死时间的体积）附件 1：舉5胡 通辺珈水忖减陆篠丈来描述柱子的特征(5-3)柱于类空H5*SpH-2 JCpH-7-DEJ不咼出桂子挞爭矣取-忖CM 1-0.60JUZ-n,BOM-n-.tiHCk-HI2.sij芟舉i!1O.MO.m-0.12QGJcu.畀4G債瓏)O.iH-aoifinnn .noftJ4.r.,J熒叠帕(iMfi.ftl-6.砧0.2i(UlJ. 2G間眠*)LUI1102lJ2-Ci.112n-.ii
6、MlIf呗njn-fli.14hllfi. 1类眾刪ftw4J3maz.nz-am“创7.4；,蹇和再：OW-O.(K(KI4n.nieg1.出匚4：(熨刊血LOS-0.01O.(W-0.02-fl脚145DJ)嵌人Pin： MMI0.T4n.o(i-cmti.12-Oi_270.处“-0.12-e.期I3.FI2O.hKJ.7就-軻花則-NJIU3.-(MW-仙4Vurnn.i2_n牛敎代輕雇奘酣一利g-OJI.25n.oi0.400.関43C.M-0-07W1fl.O3(1S7E.IK1_7真业竝.is0J54.K1丹啊村Kin哪n.EKJ-o.ffif“佃it.iy(LI?llyinir Mll.nO.SK0.00-0.(10l.lftfH4MIQSymmrtr- CHILllS0JK(k(i-H.H2-CI3f0.1.2gXlrrniMSC,；0.4Kk(nCI.|4CKIJOlMfijHiinfanr-匚1.01D.enCBW乂.01-0.1-(LLOM-9imCMtZ-3J3-1.03-ftg-0J6ILh
