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1、嵌合抗原受体（CAR）治疗的安全性摘要：输注基因定向改造的嵌合抗原受体T细胞来识别并杀灭肿瘤，已经 在许多I期临床试验中取得成功。由于会产生非肿瘤靶向和细胞因子释放综合征， 所以需要有预防或减轻严重不良反应的对策。目前正积极研究通过药物治疗、自 杀基因或其他新的办法，使其只针对恶性肿瘤有细胞毒性。在这篇综述中，我们 调查总结了嵌合抗原受体改造的T细胞的毒性，并重点发布这充满前景的细胞 治疗方法的安全性策略。关键词：嵌合抗原受体，自杀基因，安全开关，过继免疫治疗，细胞治疗1.引言同种异体造血干细胞移植（allo-HCT）是免疫治疗中一种有效方法，通过天 然免疫系统和获得性免疫系统协同产生抗肿瘤作
2、用。通过识别肿瘤相关抗原（TAAs）或次要组织相容性抗原（mHags），供体淋巴细胞输注（DLI）给移植 后白血病复发的患者可介导抗肿瘤作用。然而，由于大多数TAA自身蛋白表达异常，以致T细胞表达低亲和力T细 胞受体（TCR），排斥反应可能比移植物抗肿瘤效应（GVT）更强。虽然用于治 疗慢性粒细胞性白血病效果很好，而急性白血病异体淋巴细胞输注疗效有限，其 2年生存率不到20%。此外，并发症移植物抗宿主病（GVHD）造成病人死亡或生活质量下降占显 着比例，有报道显示接受匹配供体的造血干细胞移植的患者GVHD发生率高于 50%。虽然有报道称产生植物抗肿瘤效应（GVT）而没有发生移植物抗宿主病 （G
3、VHD）的情况，本文编译作者爱康得Paul认为两种机制的重叠，次要组织 相容性抗原（mHags）介导了移植物抗肿瘤效应（GVT）和移植物抗宿主病 （GVHD），可同时作用于造血和非造血组织。临床试验中将次要组织相容性抗原（mHags）特异性T细胞扩增并过继输注 到移植后疾病复发的患者身上，部分患者可获得暂时性完全缓解（CR），然而 此方案因果规律复杂，并且T细胞在体外扩增长达12周。长期的培养可导致T 细胞衰竭，这可能是其在患者体内持续性有限的一个潜在原因。另一个方法是利用转基因TCR或嵌合抗原受体（CAR）基因修饰的T细胞。 然而TCR转导的T细胞受HLA限制，TCR和内源性TCR错配可导致
4、亲和力降 低或表达不期望的特异性。而CAR可作为免疫治疗的通用平台，因为它不受HLA 限制。在T细胞单链杀伤装置上负载特异性抗体，这种错配的风险很低。另外， HLA识别抗原的独立机制，可以防止CAR-T细胞在抗原的处理加工中出现免疫 逃避机制。通常CAR-T只在正常细胞与肿瘤细胞间非多态地识别表面分子，以提高对 其安全的正当关切。事实上，输注CAR-T细胞使难治性白血病得到完全缓解的 同时，也会伴有细胞因子释放综合征，在靶向肿瘤相关抗原（TAAs ）的实体瘤 时甚至可出现致命的非肿瘤靶向毒性。这些问题促使美国国立卫生研究院重组 DNA咨询委员会提供了一些临床建议，包括实施小剂量递增方案，共表达
5、自杀 基因来阻断不可控毒性的或控制远期毒性。在这篇综述中，我们将讨论基因修饰的自体或异体T细胞，用于癌症免疫 治疗的安全性的当前理念和应对措施。2. CAR-T细胞的设计鉴于第一代CARs （图1A）有限的扩增和持久性，研究者在病毒特异性T 细胞表面导入CAR，为了可以让抗原递呈细胞交叉递呈的抗原产生共刺激。11 位患有进展期神经母细胞瘤的儿童给予disialoganglioside GD2第一代CAR修饰 的EB病毒特异性CTL细胞。基因修饰的细胞在几乎一半的病例体内持续了数 周的转运与介导的客观反应，11患者中3/4获得完全缓解。图1： CAR的结构和降低毒性的双靶向临床前策略。（A） C
6、AR的胞外结构包括先导 序列，单链可变区（scFv）（H （重）和L （轻）链），通过接头（如SG, GS）连接。间隔区（如 人免疫球蛋白D分子铰链区）具有柔韧性并连接跨膜区（TM）。跨膜区包括例如人免疫球 蛋白G的恒定区，胞内结构域包括CD3Z内切域（第一代的CARs），加上CD28域（第二 代），或再加一个额外的共刺激域（第三代CARs）（B）用双靶向来减少毒性反应：（i） 反式信号传导CAR将共刺激域和杀伤域分别靶向2种不同的肿瘤抗原，当只有1个抗原结 合时限制CAR的激活，ii）抑制性CAR是用抑制性信号域取代Z链，抑制了共表达活化CAR 的激活信号，（iii）串联型CAR是由单结构靶
7、向2个不同抗原的2个抗原结合片段组成的， 当它们同时结合可产生协同效应。CAR-1和CAR-2作为示例，分别识别抗原-1和抗原-2.为进一步提高CAR-T的扩增能力和持续性，研究人员在Z链中加入了一种 或多种共刺激信号域，这便分别出现了第二代和第三代CARs，主要提高CAR 修饰的T细胞扩增能力和避免T细胞诱导激活的细胞凋亡（图1A）。确实，临 床前模型证明这一尝试是成功的，后来的临床试验也证实了在CD19恶性淋巴瘤 患者中使用的二代CD19 CAR-T细胞，其扩增能力和持久性高于第一代CD19 CAR-T细胞。来自许多机构的临床试验报道了靶向复发性难治性急性淋巴细胞白血病 （ALL）的惊人疗
8、效。总的来说，已报道的CD19 CAR-T细胞控制并缓解了患者 的复发性难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）。大多数试验包括化疗清髓都是努 力为了给T细胞扩增创造一个有利的内环境。Davila等人报道在输注CD28共刺 激域的CAR-T细胞，50%成人白血病患者获得了造血干细胞移植的效果，在最 后一次随访时仍在持续缓解。Maude报告了 30名儿童和成人患者接受了 4-1BB 共刺激域的CD19 CAR-T细胞治疗，其中27例患者（90%）获得完全缓解（CR）， 包含2名blinatumomab难治性和15名接受过造血干细胞移植的患者o CAR-T细 胞在患者体内应答扩增可通过血液，骨髓和脑脊液
9、检测到。6个月的无进展生存 率为67%，总生存率为78%。研究者证实在此项试验中，患者即使不进行同种 异体造血干细胞移植，CAR治疗可能会让患者持续缓解长达2年以上。Lee等人，以学龄儿童和年轻人为主的复发性难治性急性淋巴细胞白血病 （ALL），通过CD28共刺激域的自体CD19 CAR-T治疗，70%B型急性淋巴细 胞白血病（B-ALL）患者和60%MRD阴性的患者获得完全缓解。12名治疗后 MRD阴性患者中有10名接受了异体造血干细胞移植，在中位随访中保持无疾病 状态10个月。已有报道CD19 CAR治疗难治性慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的成功案 例，而更大规模的CD19-CAR研究需
10、要在非霍奇金淋巴瘤上进行，非霍奇金淋 巴瘤的CD20 CAR-T细胞治疗初步获得了一些可喜的成绩。本文编译作者爱康 得Paul认为CAR-T治疗实体瘤的最佳疗效可能需要一些额外的修饰。尽管晚期 实体瘤患者接受抗间皮素mRNA电转导的T细胞治疗（RNA-CAR-T-meso cells） 出现肿瘤消退的证据，而神经母细胞瘤患者使用GD2靶向的CAR-T细胞治疗可 见疾病的完全缓解。通过他优秀的综述可知，CAR的靶向抗原种类在迅速增加。提高体外扩增的基因修饰的T细胞疗效的维持，自我更新，侵润以及归巢 能力正在积极的研究中。值得注意的是，在大部分研究中，T细胞激活用 CD3/CD28小体而不是可溶的
11、CD3-抗体，这可能有助于提高体内的疗效。在临床试验中需要评估，幼稚细胞还是中央记忆细胞诱导的效应T细胞， 能有更强的扩增能力、持久性和抗肿瘤活性。意大利研究小组报道，在低浓度 （IL）-7和IL-15中，用CD3和CD28抗体偶联小体激活的幼稚T细胞能促进T记 忆干细胞（TSCM）的持续和扩增，分别连续植入小鼠中，提示有自我跟新的能 力。3自体CAR T-Cells输注的副作用在临床试验中CAR-T细胞产生非肿瘤靶向作用和细胞因子释放综合征（CRS），以及在急性髓性白血病（AML）的临床前模型中有明显的骨髓抑制。严重不良事件（SAEs）可能与一些因素相关，包括输注细胞的剂量，受治 者体内的残
12、留病灶以及靶抗原在正常组织中的表达量。由于肿瘤相关性抗原也会在正常组织中表达，为了尽量降低基因重组T细 胞的毒性风险，首先应选取肿瘤细胞特异性表达的抗原。然而这样的抗原通常不 易获得，当靶向目标抗原时，进行体外和（或）体内试验来尝试预测毒性的风险。 体外细胞毒性试验充满挑战，TAA重定向的T细胞与表达目的抗原的靶向肿瘤 细胞,包括来源于正常组织的细胞，可能不会重现体内模型的三维立体复杂结构。体内动物模型包括注射人基因转导的T细胞，表达人抗原的人源化抗原转 基因小鼠模型，或在小鼠T细胞上导入CAR分子靶向鼠源相关抗原的小鼠模型。 尽管已在动物模型中对细胞因子释放综合征（CRS）和B细胞再生障碍进
13、行了研 究，但存在的一些局限性可能限制这些现象在人类中重现，人和动物的生物等效 性和生物分布之间的关联存在不同，以及有不同抗原的表达，共刺激分子的表达 和（或）细胞因子环境。非灵长类动物模型也被用来评价基因修饰的T细胞对 正常组织的毒性，其优点是它与人蛋白序列同源性程度较好。正如之前所述，为尽力提高细胞在体内扩增和抗肿瘤活性，第二、三代CAR 被开发出来。然而可以预料的是由于T细胞被高度活化和（或）协同刺激，输 注第二、三代CAR-T细胞会导致毒性风险的增加。事实上，输注第二代CAR-T 细胞会造成较高的严重细胞因子释放综合征（sCRS）发生率。在治疗实体瘤中， 由于肺上皮细胞表达低水平的HE
14、R-2，以及包含CD28和4-1BB共刺激分子的 高效CAR，靶向HER-2抗原的第三代CAR-T细胞可引发致命的肺毒性。CD19 CAR-T细胞研究中，B细胞再生障碍和细胞因子释放综合征（CRS） 常被报道。一些患者会发生令人担忧的但可逆的神经系统症状，如谵妄和癫痫发 作，后者更像是全身T细胞介导的炎症反应，而不是CAR-T细胞直接导致的脑 毒性。CAR-T细胞应用于髓性白血病已在小鼠模型中测试，进一步的临床开发 被严重的骨髓抑制所阻碍，因此必须找出克服这种严重不良反应的方法，例如备 用正常的造血干细胞和成熟的造血祖细胞。另一个潜在的严重不良反应是利用植入热点的整合型载体修饰的细胞，可能 导
15、致致癌基因失去调控而癌变。虽然在时刻监控着输注的转导干细胞，但是在临 床研究中，使用转基因T细胞导致这种严重的不良反应至今未有报道。4. 美国国立卫生研究院重组DNA咨询委员会的建议这些建议为进行CAR-T临床研究的科学家提供指导。这些建议对第一代 CAR-T细胞的临床试验（不含EB病毒特异性细胞毒性T细胞）和第二、三代 CAR-T细胞的临床试验进行了区分，在给药指导中，对细胞因子或预处理以及 输注的剂量时间提供建议。对于第一代CAR-T细胞，第一代CAR负载的EBV T 细胞，第二、三代CAR-T细胞，建议临床初始剂量分别为3x106/kg, 3x106/kg, 3x105/kg。当靶向新抗
16、原时，则建议将上述剂量分别降至3x104/kg, 1x104/kg 和1x104/kg。需要注意的是这些建议剂量基于未筛选的CAR-T细胞，而最终之 前的亚型筛选可能对毒性有影响。对于细胞因子的使用，它有助于第一代CAR-T细胞的扩增，对第二、三代 CAR-T细胞的潜在帮助仍需进一步的探讨。而进行化疗预处理则被视为对输注 的第二、三代CAR-T细胞的存活与持续有潜在的帮助。此外为降低输注细胞的毒性风险，对第二、三代CAR-T细胞输注剂量进行 拆解是必要的，比如第一天输注30%第二天输注70%（在充分的安全评估后）， 或者通过3天分别输注10%, 30%, 60%。最后，建议使用自杀基因来阻断未知的或不可控的远期毒性，尽管是否能控 制住临床明显的严重不良反应还未可知。5. 细胞因子释放综合征的治疗细胞因子释放综合征（CRS）就像炎症反应一样，临床表现为发烧，恶心， 头痛，心动过速，低血压，缺氧，以及心脏或神经系统症状。诊断标准包括：
