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1、细胞和分子生物学课程论文 学院生命科学学院专业植物学学号201*6002姓名常*2021年1月10日细胞死亡方法及其检测方法摘要：细胞因受严重损伤而累及胞核时，展现代谢停止、结构破坏和功效丧失等不可逆性改变，此即细胞死亡。细胞死亡包含坏死和凋亡两大类型。传统的细胞死亡方法分类包含细胞坏死和细胞凋亡2种，后者又称为程序性细胞死亡。死亡的原因很多，一切损伤因子只要作用达成一定强度或连续一定时间，从而使受损组织的代谢完全停止，就会引发细胞、组织的死亡。近期又发觉了很多细胞死亡的路径，为了能够对细胞死亡有更透彻的了解，我们能够从其检测方法入手，反向地学习死亡路径和方法，本文总结了最常见的检测方法。关键
2、词：细胞死亡，凋亡，坏死，检测方法，DNA片段，Abstract：Thetraditionalwayofcelldeathclassificationincludescellnecrosisandapoptosis,thelatteralsoisknownasprogrammedcelldeath,recentlywehavediscoveredalotofcelldeathpathways,inordertobehaveamorethoroughunderstanding,wecanstartwithdetectionmethodsothathaveagoodunderstandingofm
3、eansofdeath.thisarticlesummarizesthemostcommonlyuseddetectionmethodsandwillgetagreathelpforourlearning.Keywords:celldeath,Apoptosis,Necrosis,Detectionmethods,DNAfragments长久以来,细胞死亡方法分为2种,即坏死和凋亡,后者又称程序性细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)。多年来伴随研究的深入，为了能对细胞死亡的机制和路径进行更深入的了解,很多科学家发展了越来越多的检测方法。为了利于对多种检测方法的了解和选择，
4、本文对现在常见、实用及新发展的部分检测细胞死亡方法的方法进行了总结，对多种检测方法的检测原理、判定标准及优缺点进行了描述。1.细胞的死亡方法坏死坏死的机制坏死通常认为是病理性的原因造成，是一个无规则的细胞死亡方法，通常受到严重和急性的损伤(比如急性的缺氧和忽然的营养供给不足等)，严重的物理化学伤害(热、清洗剂、强碱、辐射等)全部会引发细胞的坏死。细胞内的ATP含量的降低，高浓度的ROS(氧化物)，BCL-2的大量表示引发的BCL家族蛋白表示的失衡,caspases活性被抑制，全部可能会造成细胞的坏死路径5。坏死细胞的形态学特征细胞坏死表现为细胞肿胀，细胞膜的快速崩解，细胞器的瓦解。细胞膜的崩解
5、使得细胞内容物溢出，造成细胞周围的炎症反应6。细胞核在坏死过程中的关键改变：1核浓缩(Pyknosis)：即核体积变小，染色质浓缩、深染；2核碎裂(Karyorhexis)：即核染色质凝集，崩解呈碎粒状聚体在核膜处，伴随核膜的破裂，染色质的颗粒就直接地分散于胞浆中，倘若细胞膜亦破坏，则核碎粒就可分布于细胞外；3核溶解(Karyolysis)7。凋亡凋亡的机制细胞凋亡是细胞的一个基础生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必须的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定和多个系统的发育中起着主要的作用。细胞凋亡不但是一个特殊的细胞死亡类型，而且含有主要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。
6、细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。凋亡又称程序性的死亡(Programmedcelldeath,PCD)1。凋亡除了发生在正常的细胞外，凋亡的诱发能够病理性的原因引发或由环境刺激引发，比如，DNA损伤、氧化压力、激素、病毒、毒素、药品、营养不良等，当然凋亡既可由病理性的原因引发，也能够是正常的细胞死亡网2。形成的凋亡小体最终被周围的细胞吞噬，因此避免了体内炎症的产生3。凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间很保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等，伴随分子生物学技术的发展对多个细胞凋亡的过程有了相当的认识，不过迄今
7、为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。而凋亡过程的紊乱可能和很多疾病的发生有直接或间接的关系。如肿瘤、本身免疫性疾病等，能够诱发细胞凋亡的原因很多，如射线、药品等。细胞凋亡关键有两种路径：一个是外源性的(即经细胞死亡因子受体介导的细胞凋亡)，另一个是内源性的(即经线粒体路径)。即使经过两种不一样的路径，但最终全部必需经过一个为caspases的家族组员介导的蛋白酶级联反应过程，作用于底物而造成凋亡4。也有报道在组织缺氧和酸毒症作用于心肌细胞时，细胞凋亡并不激活caspases。凋亡细胞的形态特征凋亡的细胞皱缩，细胞间的连接消失，同时细胞间的密度增加，核质浓缩成一个或多个大的包团，染色质迁移至核模周
8、围形成新月形凝集，进而细胞核裂解为碎块，进而细胞膜内陷自行分割成多个由细胞膜包裹的，表面光滑的凋亡小体(Apoptoticbody)；DNA被特异性的核酸内切酶分解成180220bp的片断，琼脂糖电泳出现特征性DNA梯状区带，在细胞凋亡早期需要大量的ATP。凋亡和坏死的区分为了愈加根本明白两种死亡方法的不一样，能够从两种的不一样特征做个比较。如表一表一：细胞凋亡和细胞坏死的区分特征细胞凋亡细胞坏死诱发原因特定的或生理性多种病理性细胞数量单个细胞丢失成群细胞死亡质膜完整保持肿胀溶解破裂细胞核固缩破裂为片段溶解破裂染色质凝集呈半月状模糊疏松线粒体肿胀通透性增加，细胞C释放肿胀破裂细胞器完整损伤内含
9、物释放无有炎症反应无有核DNA降解为完整倍数大小的片段随机不规则断裂凝胶电泳梯状条带形分散形态2.细胞死亡检测方法细胞死亡的方法可依据形态学、细胞膜通透性及染色体改变情况，并可结合多种染色或标识方法来确定。最常见的观察方法是用光镜、电镜或共聚焦荧光显微镜观察细胞、细胞核形态、细胞膜及细胞超微结构的改变，并按现在大多数学者接收的形态学标准加以判别。线粒体跨膜电位检测法线粒体膜电位是由线粒体内膜两侧质子的不对称分布而形成的电化学梯度，在细胞凋亡过程中常因膜孔道大小的改变及转膜电位的降低来调整细胞凋亡。在凋亡早期，当线粒体形态学方面尚无显著改变时，其膜电位已经发生耗散。所以，其膜电位的耗散被认为是细
10、胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，而且一旦线粒体膜电位耗散，凋亡就不可逆转。但使用该方法时要一直保持平衡染液pH值的一致性。线粒体跨膜电位的存在，使部分亲脂性阳离子荧光染料如JC-1等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。不过要注意的是，除了在凋亡中出现线粒体去极化外，在胀亡中也可发生此现象。8DNA片段检测细胞发生凋亡或坏死时，DNA发生断裂，胞质内出现DNA片段。探测DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳、酶联免疫吸附法、TUNEL法及其它检测方法如ISEL(insituendlabeling)、ISOL(InsituoligoLigation)。法TUNEL方法
11、是经过检测DNA双链断裂暴露出的粘性3c-OH末端来确定凋亡的经典方法。在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，DNA的3c-末端和荧光素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素标识的脱氧核糖核苷酸结合，从而进行凋亡细胞检测。TUNEL实际上是分子生物学和形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能正确地反应细胞凋亡经典的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离出来的细胞，并可检测出极少许的凋亡细胞，因此在细胞凋亡的研究中被广泛采取。用光学显微镜或共聚焦显微镜观察TUNEL检测结果，阳性着色的为凋亡细胞11。TUNEL法标识的是凋亡
12、晚期阶段的细胞，在此阶段,细胞形态已经显著紊乱。即使TUNEL方法能识别发生凋亡的细胞，不过有时凋亡和坏死重合，所以部分凋亡性细胞未染色。这使得在部分情况下会低估凋亡信息。而且，甲醛固定能妨碍TUNEL染色，被标识的细胞和周围正常细胞的对照性较差。在组织切片上难以确定正确结果。TUNEL染色对凋亡来说不是特异的，在胀亡中也能够见到12。琼脂糖凝胶电泳和酶联免疫吸附法凋亡细胞DNA断裂点都有规律的发生在核小体之间，出现180200bpDNA片段，而胀亡或坏死细胞DNA断裂点为无特征的弥漫性随机片段，利用这些特征使用琼脂糖凝胶电泳能够确定细胞的死亡方法。凋亡细胞经电泳后出现阶梯状(DNALadde
13、r)条带；而胀亡或坏死细胞经电泳后呈随机性电泳条带9。观察DNA最常见的方法是利用荧光染料EB进行染色。凝胶应该在无EB情况下电泳,电泳结束后用EB染色。不过要注意的是，在坏死中发生的蛋白水解路径也能造成将DNA分裂为核小体间片段的酶激活，所以也可能出现DNA阶梯状条带，这和凋亡过程中见到的情况不能区分10。凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体，核小体由组蛋白及DNA片段组成，可用酶联免疫吸附法检测。组化染料依据染料和细胞组分结合的不一样分为细胞核染料、细胞膜染料和细胞质染料。死亡的细胞和活的细胞和染料的亲和性不一样，在电镜下观察能够分辨出细胞的存活情况。细胞核染料常见的细胞核染料有Hoe
14、chst、PI、DAPI、AO(acridineorange)和EB等方法。Hoechst是一个不需要透化作用就能够穿透细胞膜并将DNA染色的的蓝色荧光染料16，是和DNA特异结合的非细胞毒性活性染料，优先和双螺旋小沟外面的三个腺嘌呤和胸腺嘧啶碱基对结合17，既可染有活力的细胞又可染发生凋亡的细胞，常见于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜(在紫外光照明下)观察或流式细胞仪检测。细胞发生凋亡时，会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染，凋亡细胞的凝缩染色质着色比正常细胞的染色质更亮。PI是一个核酸荧光染料，用作死亡或正在死亡细胞的一个标志物，因为此染料不能穿透活细胞的质膜，而只穿过受损细
15、胞膜进入细胞18，因此在凋亡晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。PI染阳性、细胞核不凝聚或断裂的细胞认为是坏死性的19。DAPI(4c,6-diamidino-2-phenylindole)DAPI也是一个标识细胞核的蓝色荧光染料，能够和DNA中大部分A、T碱基相互结合，因为DAPI能够透过完整的细胞膜，它能够用于活细胞和固定细胞的染色。DAPI染色常见于细胞凋亡检测。染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。在荧光显微镜下观察时，利用紫外光激发，显示染色体浓缩、核分成小裂片或断裂。AO为一个膜通透性活体染料，可区分正常和凋亡细胞核，在活细胞中，AO可作为一个PH指示剂，因为它
16、被酸性层包围时会发出鲜亮的黄或橘红色光。正常和凋亡性细胞核染色不一样，正常PH时,AO将双链核酸染为绿色，在凋亡过程中因为细胞核酸化、PH值降低而将凋亡细胞核染为黄或橘红色。所以，AO已被用作识别凋亡细胞的染色方法，这种简单的方法可灵活地附加到其它方法以识别和研究凋亡性细胞。如依次使用AO和EB染色，使用共聚焦显微镜观察。EB不能穿透活细胞的质膜，而只穿过受损的细胞膜进入细胞18，选择性地标识细胞膜受损的细胞，AO含有细胞渗透性，活和死亡细胞均标识。两种染色方法的结果是：活细胞核AO染色呈绿色，凋亡细胞核AO染色呈黄或橘红色；坏死细胞核深入EB染色呈红色，显示为绿色和红色光谱区共存。细胞膜染料(Annexin-V)在正常细胞,PS关键在质
