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1、正交法测几种因素对酶活的影响一、实验原1、酶反应受到多种因素的影响，如底物浓、酶浓、温、pH 值、激活剂和抑制剂等能影响酶反应速，并且各因素之间也相互影响（交互作用） 。1）底物浓对酶反应速的影响S1ro+S混合级反应一级反应米氏方程:S-零级反应2）酶浓对酶反应速的影响3）温对酶反应速的影响4)pH 对酶反应速的影响最适 pH 和最适温一样，也是一个固定的常数，最适温是一个固定 的常数，它受底物的种类、 浓；溶液的离子强、 pH、反应时间等的影响。2、正交法1) 正交法是用正交表来安排多因素试验、寻求最优水平组合的一种高效试 验设计方法。它从多因素试验的全部水平组合中挑选部分有代表性的水平组
2、合进 试验， 通过对这部分试验结果的分析解全面试验的情况， 找出最优水平组合。 2）正交法的优点：用较少的试验获得较全面的数据结果，避免了在多因素、多 水平试验中对每个因素的每个水平都互相搭配进行的全面试验，节省大量的人力、 物力，缩短了实验时间。3）正交表的正交性：I表中每一列（因素）各水平的重复数相等；n表中任意两列横向形成的有序数寸中，所有各种可能的有序数寸的重复数相同。用正交表安排的实验，具有均衡分散的特点。即按正交表挑选出来的各因素 水平组合在全部水平组合中的分布式均衡的。4）正交实验的一般流程I列出试验中的因素和水平数n选择合适的正交表皿根据正交表进行实验设计w实验并收集数据v分析
3、数据，得出结论5）结果分析I利用各因素同一水平试验指标之和及平均数，可比较因素不同水平寸试验的影响程度。n计算极差，可比较不同因素的影响程度。皿找出最佳试验条件（理论直）。3、本实验选取四个因素，即底物浓度S、酶浓度E、温度、pH直，每个因素选三个水平，选择 正交表设计实验，实验设计如下表：表 1X水平因素1S/ml2E/ml3温度/C4 pH10.20.237720.50.550830.80.86094、本实验测定的是胰蛋白酶的活力，以血红蛋白为底物，血红蛋白水解后的产物多肽或氨基酸可用Folin-酚显色，在680nm下比色夹得到产物浓度，从而通 过一定时间内生成产物的量来判断酶反应的速度。
4、二、实验试剂1、2%血红蛋白液2、15%三氯乙酸(TCA)溶液3、0.3mg/mL 牛胰蛋白酶(1：250)4、0.04mol/LpH为7、8、9的巴比妥钠HC1缓冲液5、Folin-酚试剂：Folin-A(I): -NaOHFolin-A(H):-酒石酸钾(钠)临用前将A( I )和 A(n)按50 : 1体积比混合得Folin-A试剂。Folin-B 试剂：约 1mol/L 三、实验器材 温度计、试管*30、漏斗*10、移液枪、 5mL 移液管、恒温水浴锅、紫外分光光度 计四、实验操作按下表进操作：表 2X实号 试剂/m卜1682493572%血红0.20.50.80.20.50.80.2
5、0.50.8蛋白液缓冲溶pH7pH8pH9pH8pH9pH7pH9pH7pH8液2.61.71.72.32.31.42.02.02.037C预温 5min50C预温 5min60C预温 5min酶液0.20.80.50.50.20.80.80.50.237C反应 10min50C反应 10min50C反应 10min反应 10min 后，各管均加入 15%三氯乙酸溶液 2mL 终止反应。另取试管一支做非酶对照，即加2%血红蛋白液0.5mL，缓冲液2.0mL，先加 15%TCA2mL，摇匀放置10min后再加入酶液0.5mL。将上述酶促和非酶对照各管反应液室温放置15min，过滤，滤液待Foli
6、n-酚法测定酶活。Folin-酚法测定酶活： 取滤液0.5mL，加入试剂A 4 mL，室温放置10min， 再加试剂B0.5 mL，室温静置30min后，于680nm处测吸光。五、注意事项1、应确保酶促反应的温及反应时间的准确性。2、为减少显色反应时间带来的误差， Folin 试剂的加入顺序和最后测定吸光 的顺序应保持一致，且间隔时间应尽相同。3、加入 Folin-B 试剂后应迅速摇匀，加一管摇一管，使还原反应产生于磷钼酸- 磷钨酸试剂被破坏之前。六、实验结果表 31S/ml2E/ml3温度/C4 pH试验结果11 0.21 0.2137170.22421 0.220.52502 80.194
7、31 0.230.8360390.096420.51 0.2250390.035520.520.5360170.143620.530.81372 80.582730.81 0.23602 80.068830.820.5137390.307930.830.8250170.403I0.5140.3271.1130.770n0.7600.6440.6320.844皿0.7781.0810.3070.408I/30.1710.1090.3710.257n/30.2530.2150.2110.281皿/30.2590.3600.1020.136极差0.0880.2510.2690.121以吸光度直（1/
8、3，H/3，皿/3）为纵坐标，因素的水平数为横坐标作图:由以上实验结果分析得出结论：1 ）对于因素1 （底物浓度），水平三（血红蛋白0.8mL，浓度0.267mol/L）为所比较三水平中的最适条件。2）对于因素2 （酶浓度），水平三（胰蛋白酶0.8mL，浓度0.267mol/L）为所比较三水平中的最适条件。3） 对于因素3 （温度），水平一（37C）为所比较三水平中的最适条件。4）对于因素4 （pH），水平 2 （pH=8）为所比较三水平中的最适条件。5）比较极差发现，因素3（温度）各水平的极差最大，因素1（底物浓度）各水平的极差最小，说明在本次实验考虑的各参数范围内，温度对胰蛋白酶活力 的影
9、响最大，底物浓度对胰蛋白酶活力的影响最小。七、分析与讨论1、经查阅资料得，胰蛋白酶的最适温度为37C，最适pH为7.8& 5，实验结果 符合文献值。同时，对因素 1 和因素 2 的实验结果，也符合底物浓度和酶浓度对 酶反应速影响的论。2、本次实验过程中，由于操作失误，在测定 1 号和 6 号实验管的吸光时没有 将波长调至650nm，而重做1、6号产物的显色。但最终发现，第二批显色的结 果与第一批结果明显属于同一个系。 讨论后猜测原因是，第一次与第二次做 显色时的条件并完全相同，由于试管太多，第一次加 Folin-A、 Folin-B 试剂 的间隔可能没有掌握好，而第二次单独做 1 、 6 时的时间控制得较好，而此时用 第一次制备的0 号管作为基准显然是合适的。我认为，在单独重做 1、 6 号管 的显色时应当重新做一个 0 号管作为相同条件下的比色基准才较为合。 所以这 次实验虽然侥幸得出正确的结论，但这步操作的确是合的。3、正交法设计实验对实验者的细致、严谨要求很高，因为最终的每一个数据 要被用到分析中，任意数据能舍去。 如果有某个地方做错， 就会对最后整 体的结果造成影响，可谓“牵一发而动全身，因此在实验过程中要为细致。
