《结核分枝杆菌重组蛋白的制备及抗原性分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《结核分枝杆菌重组蛋白的制备及抗原性分析（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、结核分枝杆菌重组蛋白的制备及抗原性分析苏明权，岳乔红，周萍，段艳，杨柳，杨军兰，刘家云，郝晓 柯【关键词】结核分枝杆菌；抗原；基因表达；ELISAPreparation and antigenicity assay of recombinant proteins of Mycobacterium tuberculosisAbstract】 AIM: To clone and express the Mr 16X103 and Mr 38 X 103 proteins of Mycobacterium tuberculosis in E. coli, and to characterize it
2、s antigenicity and specificity. METHODS: The Mr 16X103 and Mr 38X103 antigen genes were amplified from Mycobacterium tuberculosis genome DNA by polymerase chain reactions and cloned into pGEX4T2 expression vector after sequencing. BL21 strain of was transformed with the recombinant vectors and induc
3、ed to express recombinant proteins. The proteins were purified by affinity column chromatography. The antigenicity and specificity of purified proteins were estimated by enzymelinked immunoabsorbant assay. RESULTS: The BL21 strains of E. coli with recombinant vectors showed 42 and 18% of Mr 16 X103（
4、688 mg/L） and Mr 38X103（217 mg/L）gene expressions after induction. The sensitivity of Mr 16X103 and Mr 38 X 103 proteins were % and , specificity were 100 and 99， accuracy were and respectively. CONCLUSION: The expressions and purifications of recombinant Mr 16X103 and Mr 38 X103 antigens with good
5、antigenicity and specificity facilitate their research and clinical application in the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis.【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis； antigen； gene expression； enzymelinked immunoabsorbant assay【摘要】目的：克隆表达结核分枝杆菌Mr 16X 103和Mr 38 X103 重组蛋白，测定其抗原性和特异性. 方式： 利用聚合酶链反映 自结核分枝
6、杆菌基因组DNA扩增Mr 16X103和Mr 38X103抗原基 因，经测序鉴定后克隆于pGEX4T2表达载体，转化于大肠杆菌BL21 菌株进行诱导表达，利用GSTrapFF蛋白柱纯化表达产物，通过酶联 免疫吸附测定(ELISA)检测其抗原性与特异性.结果:携带重组质粒的 菌株经诱导产生的表达量别离为 42%和 18%；Mr 16X103 和 Mr 38 X 103蛋白量别离为：688 mg/L和217 mg/L.其中Mr 16X 103蛋白作 为包被抗原 ELISA 法检测的灵敏度为%, 特异性为 100%, 准确性 为; Mr 38X103蛋白作为包被抗原ELISA检测的灵敏度为，特异 性
7、为99%，准确性为.结论：以Mr 16X103, Mr 38X103重组蛋白 为抗原具有良好的抗原性和特异性，可用于结核分枝杆菌诊断方式的成立及临床诊断.【关键词】结核分枝杆菌；抗原；基因表达；ELISA【中图号】 R3780 引言结核病仍是目前危害全世界人类健康的重要传染病，我国每 一年约有 13 万人因结核病而死亡. 对结核病的实验诊断要紧依据细 菌学检查和血清学检测，细菌学检查繁琐费时，培育周期长，达不到 快速诊断的目的，血清学检测是一种方便快捷的实验室诊断方式，血 清学检查的关键是结核分枝杆菌特异性抗原的提呈 . 咱们利用基因 工程重组方式，通过大肠杆菌表达结核分枝杆菌的Mr 16X1
8、03和Mr 38X103蛋白，以Mr 16X103和Mr 38X103重组蛋白为抗原，通过酶 联免疫吸附实验测定两种抗原的反映性和特异性，以期证明其在血清 学诊断中的价值.1 材料和方式材料结核分枝杆菌H37RV标准株（菌株号：ATCC27294）: 购自卫生部国家菌种保留中心.DH5a, BL21由第四军医大学西京 医院查验科保留；T4连接酶、限制性核酸内切酶BamHI, EcoRI DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自Vitagene公司；GST亲 和层析柱GSTrapFF购自Pharmacia公司；pGEX4T2表达载体购自 Pharmacia 公司.方式结核分枝杆菌Mr 16X10
9、3, Mr 38X103抗原基因的PCR扩 增结核分枝杆菌H37Rv培育物经煮沸灭活，蛋白酶IK消化留宿，经 酚 氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA.通过PCR扩增Mr16X103,Mr 38 X 103基因.Mr 16 X 103抗原基因引物为： 5 AGGGGATCCATGGCCACCACCCTTCCCGTTCAG3含 BamH I 酶 切位点和起始密码子， 5TCAGCTCGAGCCCAGTGGTCAGTTGGTGGACCG3含 Xoh I 酶 切位点和终止密码子，预期扩增产物435 bp. Mr 38X103基因引物为: 5 AGGGGATCCGTGAAAATTCGTTTGCATACGCT3
10、含 BamH I 酶切位点和起始密码子，5GATGAATTCACGGAGGTTGCTGTCGCGTGGTG3含 Xoh I 酶切 位点和终止密码子，预期扩增产物1122 bp. PCR反映程序为：94C预 变性 5 min, 94C 30 s, 60C 30 s, 72C 1 min,共 30 个循环，最后 72C延伸10 min.琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果.基因的克隆与鉴定用胶回收试剂盒回收目的片段，将Mr 16 X103, Mr 38X103抗原基因与质粒pGEX4T2同时用BamH I与Xoh I双酶切，T4连接酶连接，重组质粒转化DH5a感受态细胞.利用 Vitagene公司提供的小
11、量质粒提取试剂提取质粒DNA,序列测定由上 海生工生物工程公司完成.表达载体的构建将携带Mr 16X103, Mr 38X103抗原基因的 重组质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收基因片段， Vitagene 公司凝胶抽提试剂盒纯化,连接于双酶切的 pGEX4T2 表达 载体，T4 DNA连接酶连接，转化于DH5a感受态细胞.挑选单菌落， 抽提质粒,酶切检测,并进行序列测定以证明插入序列是不是正确 . 挑选测序正确的重组表达载体质粒，再转化于BL21菌株.重组质粒的诱导表达及纯化将携带重组表达载体的BL21菌 株接种于含氨苄青霉素g/L的LB培育基，37C振荡培育留宿.然后 从中取1
12、mL接种于100 mL新鲜含氨苄青霉素的LB液体培育基， 37C振荡培育3 h,加人诱导剂IPTG至终浓度mmol/L, 37C继续 培育5 h.离心搜集菌体.将诱导前后的样本各加入2X样品缓冲液 100 L, 95C滚水浴 10 min, 10 000 g 离心 10 min,取 10 上清进 行120 g/L SDSPAGE.凝胶用考马斯亮蓝染色2 h,脱色35 h,观 看目的蛋白，用CS9000薄层扫描仪在580 nm波长下对SDSPAGE蛋 白电泳凝胶上的蛋白条带进行扫描,确信菌体总蛋白中目的蛋白比例. 用GSTrap FF蛋白纯化柱和凝血酶进行目的蛋白的纯化，按试剂盒说 明书进行，取
13、得纯化的重组结核杆菌Mr 16X103, Mr 38X103蛋白用 SDSPAGE蛋白电泳进行检测.16X103, Mr 38X103重组蛋白抗原的ELISA检测对西安地 域搜集的 94 份血清样品进行 ELISA 检测，其中肺结核患者血清 90 份（经集菌涂片染色法或培育实验证明为结核分枝杆菌阳性）,正常 健康人血清100份为阴性对照.将纯化Mr 16X103, Mr 38X103抗原 溶液稀释于PBS溶液,37C包被酶标板2 h. PBST溶液（PBS内含g/L Tween20）洗涤，再用封锁液（PBST内含1 g/L牛血清清蛋白）37C 封锁1 h,然后用PBST溶液洗涤.加入1吐血清样
14、品，37C温育1 h, PBST溶液洗涤.加入1 : 1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人 IgG, 37C温育30 min.加入四甲基联苯胺显色液，室温显色30 min 后终止反映.450 nm检测吸光度值.2 结果目的基因的扩增与克隆用蛋白酶裂解法提取的结核杆菌基 因组DNA用特异的引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，证明所 取得的PCR产物为目的基因片断，与在GenBank中查到的结核分枝 杆菌 Mr 16X103,Mr 38 X 1 03蛋白的基因大小大体一致（图1 ） . 提 取质粒，别离经双酶切后，取得435 bp和1122 bp的目的基因片段和 载体pGEX4T2的4950
15、 bp片断，而空质粒对照只取得一条4970 bp左 右的片段（图 2）. 经测序证明目的基因的序列完全正确，未发生突 变. 图 1PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳（略）1,2:空质粒pGEX4T2的BamH I和Xho I双酶切结果；3: DNA分子量标准;4,5:重组质粒pGEX16的BamH I和Xho I双酶切 结果；6,7:重组质粒pGEX38的BamH I和XhoI双酶切结果.图2重组质粒pGEX16和pGEX38的酶切鉴定（略）表达载体构建与重组蛋白诱导表达进一步测序说明， pGEX16 及 pGEX38 中的插入序列及读码框架正确. 将测序正确的 pGEX16, pGEX38和pG
16、EX4T2别离转化感受态 DH5a，在37C用 mmol/L IPTG 诱导后，别离取菌株进行120 g/L SDSPAGE. 结果说 明，pGEX16转化的菌株在Mr 42X103处显现一条新生蛋白条带， pGEX38在Mr 64X103处显现一条新生蛋白条带，均与预期结果一 致；而pGEX4T2转化的菌株那么只在Mr 26X103处有一新生条带， 说明插入的Mr 16 X 103蛋白和Mr 38 X 103蛋白基因已经成功地在大 肠杆菌中表达，并与 GST 形成了融合蛋白（图 3，图 4）. 对图 3， 图4中SDSPAGE凝胶上菌体蛋白条带别离进行凝胶薄层扫描分析， 表达的融合蛋白GST16, GST38别离约占菌体总蛋白的42%和18%.图 4GST38 融合蛋白的原核表达（略）重组蛋白的纯化经蛋白纯化后，经 SDSPAGE 蛋白电泳检 测，可看到单一的纯化蛋白泳带（图 5），紫外分光光
