紫外分光光度法原理

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1、紫外分光光度计的利用原理和方式紫外-可见分光光度法（ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS）1概念：它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分 析、定量分析及结构分析，所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的 光而产生的吸收光谱。2分类：按所吸收光的波长区域不同：分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。3、紫外-可见分光光度法的特点：（1）其仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快;（与其它光谱分析方式相较）（2）灵敏度高;（3）选择性好;（4）周密度和准确度较高;（5）用途普遍。

2、1. 紫外-可见吸收光谱1. 物质对光的选择性吸收物质对光的吸收是选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质 的特性，这确实是光谱法的基础。通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度 （吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范 围的吸收曲线。在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长入max进行物质含量的测定。2. 有机化合物的紫外-可见吸收光谱有机化合物的电子跃迁与紫外-可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成单键的。电子、形成双键 的n电子和未参与成键的n电子。跃迁类型有：o f。*、no*、n n *、 nn *四种。饱合有机化合物的电子跃迁类型为oo *, no

3、*跃迁，吸收峰一样出此刻真空紫外区，吸收峰低于200nm,实际应用价 值不大。不饱合机化合物的电子跃迁类型为n-n *,nn *跃迁，吸收峰一样大于 200nm。生色团：是指分子中能够吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。人们通常将能吸 收紫外、可见光的原子团或结构系统概念为生色团。助色团：是指带有非键电子对的基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I 等，它们本身不能吸收大于 200nm 的光，可是当它们与生色团相连时，会使生 色团的吸收峰向长波方向移动，而且增加其吸收强度。红移和紫移： 在有机化合物中，常常因取代基的变更或溶剂的改变，使其吸收带的最大吸 收波长入max发生移

4、动。向长波方向移动称为红移(表3-3)，向短波方向移动称 为紫移。有机化合物的吸收带吸收带(absorption band):在紫外光谱中，吸收峰在光谱中的波带位置。依 照电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。(1)R吸收带(2)K吸收带(3)B 吸收带(4)E吸收带3. 无机化合物的紫外-可见吸收光谱1. f电子跃迁吸收光谱镧系和锕系元素的离子对紫外和可见光的吸收是基于内层f电子的跃迁而 产生的。其紫外可见光谱为一些狭长的特点吸收峰，这些峰几乎不受金属离子的 配位环境的阻碍。2. d 电子跃迁吸收光谱过渡金属的电子跃迁类型为d电子在不同d轨道间的跃迁，吸收紫外或可见光 谱。这些峰强烈

5、受配位环境的阻碍。例如Cu2+以水为配位体，吸收峰在794nm 处，而以氨为配位体，吸收峰在 663nm 处。此类光谱吸收强度弱，较少用于定 量分析。3. 电荷迁移光谱 某些分子既是电子给体，又是电子受体，当电子受辐射能激发从给体外层轨 道向受体跃迁时，就会产生较强的吸收，这种光谱称为电荷迁移光谱。如苯酰基 取代物在光作用下的异构反映。阻碍紫外-可见吸收光谱的因素物质的吸收光谱与测定条件有紧密的关系。测定条件（温度、溶剂极性、pH 等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生转变。1. 温度：在室温范围内，温度对吸收光谱的阻碍不大。2. 溶剂 ：注意如下几点：（ 1）尽可能选用

6、低极性溶剂；（2）能专门好地溶解被测物，而且形成的溶液具有良好的化学和光化 学稳固性；（3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。3. pH 值紫外-可见吸收光谱的应用 紫外-可见吸收光谱除要紧可用于物质的定量分析外，还能够用于物质的定 性分析、纯度鉴定、结构分析。1. 定性分析2. 纯度的鉴定：用紫外吸收光谱确信试样的纯度是比较方便的。如蛋白质与核酸 的纯度分析中， 可用 A280/A260 的比值，鉴定其纯度。3. 结构分析紫外-可见吸收光谱一样不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴 定化合物中的共轭结构和芳环结构仍是有必然价值。例如，某化合物在近紫外区 内无吸收，说明该物质无共轭结构和

7、芳香结构。2. 朗伯-比尔定律一、吸光度和透光度设入射光强度为10，吸收光强度为la,透射光强度为It，反射光强度为Ir， 那么： I0= Ia + It + Ir ，由于反射光强度大体相同，其阻碍可彼此抵消，上式可 简化为：I0= Ia + It，透光度：透光度为透射光的强度It与入射光强度I0之比， 用 T 表示：透射光的强度It透光度 T = 入射光强度 I0 即 T= It / I0 吸光度：为透光度倒数的对数，用A表示，即A = lgi/T= lg io/it二、朗伯-比尔定律朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的 吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比

8、，即溶液的吸光度=A= k c l式中比例常数k与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为吸 光物质浓度，l为透光液层厚度。（朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论 基础。）三、吸光系数当l以cm，c以g/L为单位，k称为吸光系数，用a表示。A= a cla 的单位为 L/吸光系数分为：摩尔吸光系数和比吸光系数 摩尔吸光系数：当l以cm，c以mol/L为单位，k称为摩尔吸光系数，用表示。 的单位为L/,它表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时，溶液 的吸光度。比吸光系数：比吸光系数是指百分含量为1%, l为1cm时的吸光度值，用 表示 二 0.1M E1%r 1cm四、偏

9、离朗伯-比耳定律的因素（1）入射光为非单色光（2）溶液的不均性。实际样品的混浊，加入的爱惜胶体，蒸馏水中的微生物，存在散射和共 振发射等，都可吸光质点的吸光特性转变大。（3）光程的不一致性。 光源不是点光源，比色皿光径长度不一致，光学元件的缺点引发的多次反 射等，均造成光径不一致，从而与定律偏离。3. 紫外-可见分光光度计一、要紧部件的性能与作用大体结构:光源f单色器f吸收池f检测器f信号显示系统t样品1、光源：在紫外可见分光光度计中，经常使用的光源有两类:热辐射光源和气 体放电光源热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢 灯和氘灯。2、单色器单色器的要紧组成：入

10、射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部份。单色 器质量的好坏，要紧决定于色散元件的质量。色散元件经常使用棱镜和光栅。3 吸收池：吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为：玻璃吸收池（不能用于紫外区）和石英吸收池 吸收池的种类很多，其光径可在10cm之间，其中以1cm光径吸收 池最为经常使用。4、检测器检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变成电信号。现今利用的分光光度计大多采纳光电管或光电倍增管作为检测器。5、信号显示系统 经常使用的信号显示装置有直读检流计，电位调剂指零装置，和自动记录和数字显示装置等。二、紫外-可见分光光度计的类型按其光学系统可分为单波长分光光度计和双波长分光光度计。1. 单

11、波长单光束分光光度计目前国内普遍采纳 721 型分光光度计。具有结构简单、价钱低廉、操作方便、维修也比较容易，适用于常规分析。单波长单光束分光光度计还有国产751 型、XG-125型、英国SP500型和伯克曼DU-8型等。2. 单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计有国产710型、730型、740型、日立UV-340型 等就属于这种类型。3. 双波长分光光度计双波长分光光度计的优势：是能够在有背景干忧或共存组分吸收干忧的情形 下对某组分进行定量测定。国产WFZ800-5型、岛津UV-260型、UV-265型等。 三、分光光度计的校正和查验1. 波长校正2. 吸光度校正3. 杂散光的查验4

12、. 稳固性的查验4 分析条件的选择一、 仪器测量条件的选择1.适宜的吸光度范围由朗伯-比尔定律可知:A = lgi/T = e cl微分后得:dlgT=T= - e Idc或AT/T= -e lAc代入朗伯-比尔定律有:Ac/c=AT/TlgT要使测定的相对误差Ac/c最小，求导取极小得出:lgT=A即当A=时，吸光度测量误差最小。最适宜的测量范围为之间。2. 入射光波长的选择一般是依照被测组分的吸收光谱，选择最强吸收带的最大吸收波长为入射 波长。当最强吸收峰的峰形比较尖锐时，往往选用吸收稍低，峰形稍平坦的次强 峰或肩峰进行测定。3. 狭缝宽度的选择为了选择适合的狭缝宽度,应以减少狭缝宽度时试

13、样的吸光度再也不增加为 准。一样来讲，狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的十分之一。二、显色反映条件的选择 对多种物质进行测定，常利用显色反映将被测组分转变成在必然波长范围有 吸收的物质。常见的显色反映有配位反映、氧化还原反映等。 这些显色反映，必需知足以下条件：1.反映的生成物必需在紫外-可见光区有较强的吸光能力，即摩尔吸光系数 较大；2反映有较高的选择性，即被测组分生成的化合物吸收曲线应与共存物 质的吸收光谱有明显的不同；3. 反映生成的产物有足够的稳固性，以保证测量进程中溶液的吸光度不 变；4. 反映生成物的组成恒定。1酸度 显色反映最适宜的酸度范围可通过实验来确信：测定某一固定浓度的试样的

14、 吸光度随酸度的变化，以吸光度为纵坐标，溶液的 pH 值为横坐标作图。2.显色剂的用量3. 显色时刻和温度三、参比溶液的选择 测定试样溶液的吸光度，需先用参比溶液调剂透光度（吸光度为 0）为 100%， 以排除其它成份及吸光池和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误差。 参比溶液的选择视分析体系而定，具体有：1溶剂参比试样简单、共存其它成份对测定波长吸收弱，只考虑排除溶剂与吸收池等因素；2试样参比 若是试样基体溶液在测定波长有吸收，而显色剂不与试样基 体显色时，可按与显色反映相同的条件处置试样，只是不加 入显色剂。3试剂参比若是显色剂或其它试剂在测定波长有吸收，按显色反映相同的条件，不加入试样，一

15、样加入试剂和溶剂作为参比溶液。4. 平行操作参比 用不含被测组分的试样，在相同的条件下与被测试样同时 进行处置，由此取得平行操作 参比溶液。5 测定方式 一、 单组分定量方式 单组分：是指样品溶液中含有一种组分，或是在混合物溶液中待测组分的吸 收峰与其他共有物质的吸收峰无重叠。其定量方式包括校准曲线法、标准对照法 和吸收系数法。1 校准曲线法方式：配制一系列不同含量的标准溶液，选用适宜的参比，在相同的条件下，测 定系列标准溶液的吸光度，作 A-c 曲线，即标准曲线，也可用最小二乘数处置，得线性回归方程。在相同条件下测定未知试样的吸光度，从标准曲线上就能够够找到与之对 应的未知试样的浓度。2、标准对照法 即将待测溶液与某一标样溶液，在相同的条件下，测定各自的吸光度，成立朗 伯-比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。 As = K c s； Ax = K c x3Ac AC _sxx As6 紫外-可见分光光度法在医学查验中的应用例 1. 血清铜的测定例